Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de origen vegetal
y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán, et al., 2006). Como microorganismo
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
cerevisiae (Muñoz y Poutou, 1999), microorganismos tomados del banco de cepas del
Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad Javeriana.
Obtención del sustrato fermentable
Residuo Vegetal
Se utilizaron residuos de crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de un cultivo localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a una caracterización físico-química en un laboratorio certificado por el ICA (Instituto colombiano Agropecuario).
Pretratamiento del residuo vegetal Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)
Se redujo de tamaño el residuo vegetal realizando molienda, se lavaron con SDS (Sodio Dodecil Sulfato) al 1% (p/v) para posteriormente ser sometidos a ebullición por un periodo de una hora en SDS al 1% (p/v) y se realizaron lavados con agua destilada. Luego fueron secados a 55°C y por último, se sometió a un proceso de esterilización (Guevara y Zambrano, 2006).
Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa)
En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo vegetal molido y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta mezcla fue llevada a un baño termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró y lavó con agua destilada. Por último se
sometió a un proceso de secado en horno de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).
Adicionalmente, como control, se estudió el residuo molido y sin ningún tratamiento.
Pretratamiento biológico
Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico
Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la mayor concentración de azúcares reductores.
Preparación del inóculo
Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al 1% (p/v), cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/- 0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz 48 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las colonias para preparar una suspensión en
solución salina 0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml.
En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los 10ml de preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.
Fermentación discontinua
Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal suplementado (SVS) estéril a la concentración correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L fue: residuo vegetal a las diferentes concentraciones, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, (Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y se controlaron las condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de 130 rpm. Adicionalmente, se realizaron cultivos con la concentración de residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) sin la adición de los demás componentes (sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo SV). Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas, evaluando la producción de azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), pH y actividad enzimática (Guevara y Zambrano, 2006; Sun y Cheng, 2002).
Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de eliminar la población celular.
Determinación de actividad celulolítica cuantitativa
Esta técnica se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes (37 y 50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una unidad celulolítica (UC) equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta en buffer fosfato 0.1M pH 7 +/- 0.2 y en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5. La mezcla final se incubó en baño termostatado a 37°C y 50ºC, respectivamente, durante 1 hora. Finalizado el tiempo de incubación de cada muestra se frenó la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos (Guevara y Zambrano, 2006; Sun y Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005). Posteriormente se centrifugó cada muestra por 10
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz minutos a 5000 rpm. A partir del sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959).
Evaluación del Sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
A partir de las concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccionó el sustrato fermentable
que aportó mayor concentración de azúcares reductores para la fermentación con S. cerevisiae.
Como control de la cepa se realizaron fermentaciones en caldo YGC cuya composición es en g/L: extracto de levadura 5, D-glucosa 20 y cloramfenicol 0.1, pH final 6.6 (Merck, 2000), y se llevó a cabo la modificación de este medio de cultivo al utilizar 2g/L de glucosa para comparar con el sustrato fermentable.
Preparación del inóculo
La cepa de S. cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composición es en g/L: extracto de levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9, pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo condiciones controladas de 30ºC por 12 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las colonias de la levadura para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), con una absorbancia de 0.8 a 620nm.
En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml de preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.
Fermentación discontinua
Se adicionaron 1350mL del respectivo caldo (YGC, YGC modificado y SF) estéril a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo, y se controlaron las condiciones de operación: temperatura 30°C por 16 horas para cultivo con YGC y 32 horas para el SF con agitación de 70rpm, tomando muestras cada dos horas. A estas muestras se les determinó la concentración de biomasa por el método de peso seco (Godoy, 2002), de azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959) y de etanol por cromatografía líquida (HPLC).
Determinación de etanol
El contenido de etanol se analizó por cromatografía líquida de alto desempeño HPLC, en un cromatógrafo WATERS, con detector de indice de refracción (Waters Corporation, Milford,
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz MA). La fase móvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se empleo una columna Sugar Pak I con precolumna KC-G (Waters Corporation, Milford, MA). La temperatura de la columna fue 84°C. Para el análisis de los resultados se usó el programa Millenium V 2.15.01. Para la determinación de los factores de respuesta se utilizaró glucosa grado cromatográfico (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analítico Merck (Darmastadt, Alemania).
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se utilizó el programa SPSS versión 14 en el cual se determinaron las medias (nivel de confianza 95%), la desviación estándar, el coeficiente
de variación y la estadística de prueba de la distribución t student para comparar la concentración
de azúcares liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la
concentración celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el SF (Daniel,
2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN