5.2.1. Microorganismos
Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de origen vegetal y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán y Pérez 2006)
5.2.2. Residuo Vegetal
Se utilizaron residuos de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de un cultivo localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a una caracterización físico-química en un laboratorio certificado por el FCA. A los residuos vegetales se les realizó pretratamiento tanto químico, como biológico para obtener el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), éste fue la fuente de carbono (azúcar fermentable: glucosa) para ser utilizado como sustrato fermentable en la producción de etanol con células libres de Saccharomyces cerevisiae.
5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal
El objetivo de estos procedimientos fue aumentar la susceptibilidad del residuo vegetal, al reducir la cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad y de esta manera obtener un extracto crudo con mayor concentración de glucosa; por lo tanto, se seleccionó el mejor pretratamiento por análisis de medias (Daniel, 2002; Romano, et al., 2005).
5.2.3.1. Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)
Los residuos vegetales de Crisantemo se lavaron con SDS (Sodio Dodecil Sulfato) al 1% (p/v) y se redujo de tamaño realizando molienda, para posteriormente ser sometidos a ebullición por un periodo de una hora con SDS al 1% (p/v). Luego se realizó un secado a 55°C y por último, se sometió a un proceso de esterilización (Guevara y Zambrano, 2006).
5.2.3.2. Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa)
En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo vegetal molido y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta mezcla fue llevada a un baño termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró y lavó con agua destilada. Por último se sometió a un proceso de secado en horno de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).
El residuo vegetal fue sometido a diferentes pretratamientos todos con reducción de tamaño:
• Lavado con SDS.
• Lavado con SDS y tratado con peróxido de hidrógeno.
• Sin lavado con SDS y sin tratamiento con peróxido de hidrógeno (Control). • Sin lavado con SDS y con tratamiento con peróxido de hidrógeno.
Todos los anteriores se sometieron a temperatura de 50°C por 12 horas, condiciones del pretratamiento con peróxido de hidrógeno.
5.2.4. Pretratamiento biológico
5.2.4.1. Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico
Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la mayor concentración de azúcares reductores.
5.2.4.1.1. Preparación del inóculo
Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al 1% (p/v), cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/- 0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por 48 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las colonias para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml, la cual fue obtenida para el inóculo de bacterias igualando al tubo 5 de McFarland. En el caso del inóculo del actinomiceto se realizó el recuento en cámara de Neubauer para obtener la misma concentración en el consorcio.
En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los 10ml de preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.
5.2.4.1.2. Fermentación discontinua
Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal estéril a la concentración correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L es: residuo vegetal a las diferentes concentracines, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, (Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y se controlaron las
condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de130 rpm. Adicionalmente, como control se realizó una fermentación con la concentración de residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) sin la adición de los demás componentes (sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo SV), esto para verificar si el residuo proporcionaba todas las fuentes nutricionales para el desarrollo de los microorganismos celulolíticos.
Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas. Para cada muestreo, se tomaron 6 mL distribuidos así: 1mL para evaluar la producción de azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), 2mL para determinación de pH, 3mL para determinación de actividad enzimática.
Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de eliminar la población celular.
Se seleccionó la concentración de residuo vegetal que arrojó mayor cantidad de azúcares; éste sustrato fermentable obtenido, fue sometido a la técnica de cromatografía líquida HPLC para evaluar la concentración de glucosa, sacarosa y celulosa disponible.
5.2.5. Determinación de actividad celulolítica cuantitativa
Esta se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes (37 y 50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo (Guevara y Zambrano, 2006).
5.2.5.1. Actividad celulolítica a pH 7
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta
en buffer fosfato 0.1M pH 7 +/- 0.2 (Anexo A1). La mezcla final se incubó en baño termostatado a 37°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la muestra por 10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Guevara y Zambrano, 2006).
5.2.5.2. Actividad celulolítica a pH 5
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5 +/- 0.2 (Anexo A2). La mezcla final se incubó en baño termostatado a 50°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la muestra por 10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Sun y Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005).