El sustrato fermentable con una concentración de 2.547 g/L de azúcares reductores se obtuvo al realizar la fermentación de 12 horas con el consorcio celulítico en el residuo vegetal de Crisantemo al 10% sin pretratamiento ni suplemento (Figura 13).
La evaluación del SF se llevó a cabo en una fermentación con Saccharomyces cerevisiae por 32 horas, se determinó concentración de biomasa por peso seco, de azúcares reductores por la técnica de DNS y producción de etanol por cromatografía líquida HPLC.
Figura 13. Fermentación del sustrato fermentable con células libres de Saccharomyces cerevisiae
El SF fue sometido a esterilización por 30 minutos a 20 lb de presión, además se le adicionó ampicilina en una concentración de 300mg/L; esto debido a la presencia del bacilo esporulado del consorcio celulolitico que podría ser un contaminante en esta parte del proceso. Lo anterior se determinó al realizar pruebas preliminares que demostraron la resistencia de este microorganismo a la esterilización en condiciones normales (15min, 15 lb de presión a 121°C), además, no se evidenció algún efecto por parte de la ampicilina sobre Saccharomyces cerevisiae, por ser un antibiótico bactericida que inhibe la síntesis del peptidoglicano.
El inóculo se realizó bajo las mismas condiciones que en la fermentación control, se propagó en caldo YGC para asegurar una alta concentración de biomasa al iniciar la fermentación. El inóculo presentó una concentración celular de 2.8 g/L, un recuento de 40 x 106 UFC/mL, y una concentración de azúcares de 0.38 g/L.
Las condiciones durante las 32 horas de fermentación fueron iguales a las del control, es decir que la concentración de oxígeno fue reducida por el volumen efectivo de trabajo utilizado y la mínima agitación (70 rpm).
La levadura en el SF tuvo una fase exponencial hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de 2.594 g/L, de azúcares reductores 1.09g/L y un rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s) de 1.45 g/g; desde de la hora 14 se observó la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual, la biomasa disminuyó entrando a la fase de muerte y la concentración del sustrato se mantuvo estable. El consumo de azúcares reductores fue rápido hasta la hora 14, terminando la fermentación con una concentración de 0.667 g/L (Figura 14), estos posiblemente pueden ser azúcares reductores no asimilables por Saccharomyces cerevisiae como la celobiosa, que es producto de la hidrólisis de la celulosa del residuo vegetal de Crisantemo.
Al comparar la cinética de Saccharomyces cerevisiae en el SF con el control de 2g/L de glucosa, se encontró una diferencia en fase exponencial, en el control fue hasta la hora 6 y en el sustrato fermentable hasta la hora 14, se determinó que la levadura presenta una fase de adaptación hasta la hora 4, posiblemente porque el inóculo se propagó en caldo YGC; razón por la cual, la fase logarítmica se prolongó unas horas más. Por otra parte, no fue posible comparar con el control de 2g/L de glucosa, la velocidad de crecimiento (µx); ya que la fermentación en el SF no cumple con la cinética de orden 1, por esto solo se determinó el tiempo de duplicación el cual fue de 57 min y 46.5 min, respectivamente, esto evidenció que la levadura tiene un crecimiento más rápido en el sustrato fermentable.
El comportamiento de la biomasa en la fermentación evidenció que el SF puede ser considerado como un medio que permite el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae al suplir ciertos requerimientos nutricionales como la fuente de carbono, de nitrógeno, fósforo, azufre y elementos traza. Según la caracterización de composición nutricional el SF contiene 0.87g/L de nitrógeno total, 0.41 g/L de fósforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro, magnesio y manganeso en bajas concentraciones (Anexo I); estas fuentes nutricionales
promueven el crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros componentes al sustrato fermentable, ya que se obtuvo un tiempo de duplicación menor, una concentración de biomasa similar y el mismo rendimiento (Y x/s) que en caldo YGC (medio sintético) de la fermentación control 2 g/L de glucosa. Este SF es una alternativa como medio de cultivo que proporciona ventajas en cuanto a costos y composición nutricional al tener además elementos traza que no se encuentran en el medio convencional (YGC), lo que favorece la producción de biomasa.
El pH fue aumentando en función del tiempo de 6.38 a 6.8 (Figura 14), esto evidenció que el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae puede darse en un rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH intracelular entre 5.8 y 6.3 (Tuite, 1991). Varios autores reportan que el pH ácido (4.5 – 5) es una de las condiciones óptimas para la levadura al incrementar la producción de biomasa y de etanol (Yu y Zhang, 2004; Martín, et al, 2005; Palmarola, et al, 2005). En este estudio se realizó una prueba preeliminar para determinar si el pH 4.5 favorecía la producción de etanol por parte de la cepa utilizada; se concluyó que el pH entre 6 y 7 mostró mejores resultados, ya que a pH ácido no hubo producción de etanol (datos no mostrados).
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 TIEMPO (h) B IO M A S A ( g /L ) - p H 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
BIOMASA (g/L) pH AZÚCARES REDUCTORES (g/L)
Figura 14. Concentración de biomasa y azúcares reductores en función del tiempo. Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF.
Al analizar los datos de cromatografía líquida se obtuvo una concentración promedio de etanol de 3.5 g/L (Anexo J3) y un rendimiento (Yp/s) de 1.73 g/g, en la hora 10 de fermentación. En la fase estacionaria la concentración de etanol estuvo estable hasta la hora 28, en la cual disminuyo posiblemente, porque la levadura lo empezó a consumir como fuente de carbono (Tabla 3). Esto indica que la producción de etanol si esta directamente asociada con el metabolismo energético, es decir, que la velocidad de producción esta relacionada con la demanda de energía de las células; por esto, el etanol se sintetiza en las rutas de formación de ATP (Doran, 1995).
A la hora 24 del proceso el rendimiento (Yp/s) mostró un resultado de 0.46 g/g, pero los demás rendimientos fueron mayores al teórico 0.51 g/g, posiblemente, por la presencia de sacarosa en el sustrato fermentable, azúcar que fue detectado en el análisis cromatográfico y no por la técnica de DNS por ser un azúcar no reductor. Pues S. cerevisiae seguramente hidrolizó la sacarosa en glucosa y fructosa durante el tiempo de fermentación, esto ocasionó la determinación de valores no reales de la concentración de azúcares reductores, por esta razón el rendimiento fue muy alto.
Tabla 3. Determinación de etanol fermentación en SF Hora Rendimiento Y(p/s) (g/g) Etanol g/L %v/v etanol 10 (Fase exponencial) 1.73 3.5 0.45 18 (Fase estacionaria) 0.85 3.536 0.45 22 (Fase estacionaria) 0.613 3.750 0.48 24 (Fase estacionaria) 0.46 3.627 0.47 28 (Fase estacionaria) 0.21 2.212 0.28
Al comparar estos resultados con el control de 2g/L de glucosa se corroboró que Saccharomyces cerevisiae si puede producir etanol con esta mínima concentración de glucosa. Aunque en el SF la concentración de etanol fue mayor que el control, esto confirmó que el SF si es un medio nutritivo, natural y económico que
proporciona los requerimientos para el crecimiento de la levadura y la producción de etanol con mejores resultados que el medio de cultivo sintético YGC; ya que, además de glucosa tiene otros azúcares como fructosa y sacarosa que S. cerevisiae puede fermentar (Anexo J4).
De acuerdo al análisis de medias se determinó que la mayor concentración de biomasa se obtuvo en la fermentación control con 20g/L de glucosa, además, los datos de las repeticiones de cada fermentación no presentaron una amplia dispersión (Anexo H). Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control con 2 g/L de glucosa y la fermentación del sustrato fermentable se llevo a cabo la estadística de prueba con la distribución t student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho). Por lo tanto, se afirma que no existe evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular promedio de S. cerevisiae tanto en el control como en el sustrato fermentable evaluado (p > 0.05) (Anexo K).
CONCLUSIONES
• Los tratamientos con SDS y Peróxido de hidrógeno mostraron inhibición de la actividad enzimática del consorcio celulolítico.
• El residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere pretratamiento químico por la proporción mínima de lignina 0.51% y hemicelulosa 2.03%, solo es necesario la reducción de tamaño para obtener mayor concentración de azúcares reductores liberados por parte del consorcio celulolítico.
• El residuo vegetal de Crisantemo no requiere de suplemento para liberar mayor concentración de azúcares reductores por parte del consorcio celulolítico.
• Se seleccionó el residuo vegetal al 10% (p/v), el cual mostró una mínima diferencia con el 12% (p/v) al comparar la concentración de azúcares reductores liberados en las fermentaciones de las tres concentraciones evaluadas.
• El proceso para la obtención del sustrato fermentable consta de las siguientes etapas: reducción de tamaño, fermentación discontinua con el consorcio celulolítico (35ºC por 12 horas, 130 rpm), centrifugación y filtración.
• Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un consorcio celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentración de azúcares reductores de 2.547 g/L.
• Al comparar la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae entre las fermentaciones control de 20g/L y 2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el rendimiento Yx/s fue igual en las dos últimas 1.44 g/g, mejor que el obtenido con 20g/L.
• El tiempo de duplicación fue mayor en el sustrato fermentable, demostrando mayor velocidad de crecimiento comparado con el control de 2 g/L de glucosa.
• La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada mostró baja producción de etanol tanto en caldo YGC como en el SF.
• Los rendimientos Yp/s de la fermentación control 2 g/L y del SF fueron mayores que el teórico, seguramente por la presencia de sacarosa, azúcar que no se cuantifico durante el proceso.
• No existió evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa como en el sustrato fermentable evaluado.
• El sustrato fermentable permitió la obtención de etanol con una concentración de 3.75 g/L usando S. cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de glucosa 2.8 g/L.
• El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, al tener fuente de carbono, nitrógeno, sales y elementos traza.
RECOMENDACIONES
• Evaluar otras cepas de microorganismos celulolíticos en el residuo vegetal de Crisantemo, que puedan presentar mayor actividad enzimática, para obtener un sustrato fermentable con alta concentración de azúcares reductores.
• Utilizar técnicas de inmovilización de microorganismos en la obtención del sustrato fermentable y en la producción de etanol.
• Estudiar la producción de etanol a partir del sustrato fermentable utilizando otra cepa capaz de fermentar los azúcares reductores presentes.
• Utilizar el sustrato fermentable para producción de biomasa o suplemento nutricional para suelos o procesos de compostaje.
• Evaluar el crecimiento de otros microorganismos en el sustrato fermentable, al ser una alternativa como medio de cultivo.
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