En este trabajo se utilizaron técnicas de proteómica para llevar a cabo un análisis de la expresión diferencial de proteínas en el tejido adiposo omental de pacientes con PCOS. El procedimiento a seguir en cualquier estudio proteómico consiste en tres pasos fundamentales: i) preparación de las muestras, ii) separación de las proteínas e iii)
identificación mediante espectrometría de masas (MS). Como método de separación se eligió la técnica de electroforesis bidimensional que consiste en la separación de las proteínas en función de la carga y del peso utilizando para ello una primera separación mediante isoelectroenfoque (IEF) en gradiente de pH, seguida de una electroforesis en gel de acrilamida con SDS (SDS-PAGE).
3.5.1.1. Protocolo básico de 2DE.
Se extrajeron extractos de proteína total a partir de tejido adiposo omental, disgregando el tejido con un homogeneizador mecánico. Se utilizó un tampón de lisis conteniendo 8.4 M Urea, 2.4 M Tiourea y 5% CHAPS, probándose distintos agentes reductores (DTT o TCEP- HCl). El homogeneizado obtenido se incubó a temperatura ambiente durante 1h bajo agitación suave y posteriormente, se centrifugó en una ultracentrífuga TL-100 (Beckman) a 75,000 rpm durante 90 min a 19 ºC, descartándose el precipitado de material insoluble y la fracción lipídica. La fase soluble con las proteínas se conservó a -80 ºC en alícuotas hasta su uso. La concentración de proteínas fue cuantificada mediante el método de Lowry siguiendo el protocolo y las soluciones del kit RC/DC Protein Assay (Biorad), que lo hacen compatible con altas concentraciones de detergentes y agentes reductores usados en el tampón de lisis.
El isoelectroenfoque de las proteínas se realizó en tiras individuales de poliacrilamida de gradiente de pH inmovilizado (IPG, Immobiline DryStrips, GE Healthcare) con el sistema IPGPhor (GE Healthcare) siguiendo las recomendaciones de la casa comercial, con la introducción de pequeñas modificaciones en el programa de IEF con objeto de mejorar el enfoque y resolución de las proteínas del tejido adiposo (Tabla 2.3). Se utilizaron tiras de distintos gradientes de pH (3-10, 4-7 y 6-11) y con distintos tamaños (11 y 18 cm) para aumentar la cantidad de proteína a analizar y, con ello, el número de manchas resueltas en los geles. Se utilizaron dos métodos distintos de aplicación de la muestra: hidratación en gel y cup- loading, en función del pH de las tiras IPG utilizadas, ajustando para ello los requerimientos del tampón de carga, recomendados para cada caso (Corton et al., 2004). La tiras se hidrataron en una solución conteniendo 7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS y tampón IPG al 0.5%, con concentraciones variables de agentes reductores o con HED, en función del intervalo de pH utilizado. El programa de IEF utilizado también fue modificado en función del tamaño y pH de las tiras y puesto a punto para cada una de las distintas condiciones.
Con el fin de resolubilizar las proteínas y reducir los puentes disulfuro, las tiras IPG se equilibraron tras el IEF durante 15 min en un tampón de equilibrado (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 30% v/v glicerol, 4% w/v SDS, con trazas de azul de bromofenol)
suplementado con 10 mg/ml DTT. Seguidamente, se equilibraron otros 15 min en el mismo tipo de tampón con 25 mg/ml de iodoacetamida para prevenir la reoxidación de los grupos tiol durante la electroforesis.
La segunda dimensión se realizó en un sistema de electroforesis vertical, el sistema MiniProtean (Biorad) para tiras de 11 cm y el sistema Protean II XL (Biorad) para tiras de 18 cm. Se emplearon geles de poliacrilamida al 10-12.5% con SDS usando los protocolos habituales.
Tabla 2.3. Programa básico de isoelectroenfoque.
Paso Volta e (V) j Duración (h:min) Voltios-hora (Vh)
1 30 6 180 2 60 6 360 3 120 1 120 4 200 1 200 5 500 1 500 6 1000 1 1000 7 1000-8000 1:30 7750 8 8000 Variable* Variable*
* El voltaje total necesario para el enfoque de las proteínas varía en función del tamaño y pH de la tira, alrededor de 15000 y 40000 Vh para tiras de 11 y 18 cm, respectivamente.
Todas las tiras IPG se enfocaron a 0.05 mA/tira IPG.
Los geles se tiñeron con plata siguiendo el protocolo del kit PlusOne Silver Staining (GE Healthcare), con ligeras modificaciones para hacer compatible este método de tinción con el análisis por espectrometría de masas. Para ello, se omite el glutaraldehído en la solución de sensibilizado y el formaldehído en la solución de nitrato de plata (Shevchenko et al., 1996). Las imágenes se digitalizaron a una resolución de 300 puntos por pulgada con un densitómetro específico para geles 2-DE (GS-800 Calibrated Densitometer, Biorad) y con el programa PD-Quest versión 7.1 (Biorad), utilizado asimismo en el análisis posterior de las imágenes.
3.5.1.3. Protocolo de 2DE-DIGE.
Con el fin de eliminar contaminantes que pudieran interferir en la reacción de marcaje, los extractos proteicos, preparados tal como se recoge en el apartado anterior, fueron precipitados utilizando el kit 2-D Clean Up (GE Healthcare). El precipitado se resuspende en
un tampón conteniendo 7M Urea, 2M Tiourea, 4% CHAPS y 30 mM Tris, ajustando el pH a 8.5.
Esta técnica se caracteriza por el empleo de un estándar interno constituido por la mezcla equimolecular de todas las muestras a analizar. Este patrón interno se carga en cada uno de los geles del experimento junto con muestras de los dos tipos fenotípicos a comparar. Para ello, las muestras se marcaron de forma diferencial con tres tipos de fluorocromos, Cy3, Cy5 ó Cy2 (CyDye™ DIGE Dyes, GE Healthcare), según las instrucciones del fabricante, en condiciones de marcaje mínimo: 400 pmol de fluorocromo para cada 50 µg de proteína. Estos fluorocromos presentan un grupo éster NHS reactivo diseñado para producir una unión covalente al grupo amino γ de los residuos de lisina. En estas condiciones de marcaje se marcan únicamente el 3% las de proteínas presentes y sólo en una única lisina por molécula de proteína (Alban et al., 2003). Tras 30 min de incubación en hielo y en oscuridad, se paró la reacción de marcaje con lisina 10 mM.
El IEF se realizó en tiras IPG de 24 cm de longitud y rango de pH 4-7. Después de hidratar las tiras en 450 µl del tampón de hidratación (7M Urea, 2M Tiourea, 2% CHAPS, 40 mM Tris-Cl) con 1.2% de HED y 0.7% de tampón IPG pH 3-10 (Pharmalytes, GE Healthcare), la muestra se cargó mediante el procedimiento de cup-loading. En cada gel se cargaron en total 150 µg de proteína en un volumen final de 100 µl de solución de hidratación suplementado con 2 mg/ml DTT y 0.7 % (v/v) de tampón IPG pH 3-10. Seguidamente, la muestra se enfocó siguiendo el programa de isoelectroenfoque reflejado en la tabla 2.4.
La separación en geles SDS-PAGE se realizó en el sistema de electroforesis Ettan DALT Six (GE Healthcare). Los geles se polimerizaron al 12.5% de acrilamida en cristales de baja fluorescencia. La separación electroforética se realizó en una etapa de 30 minutos a 2.5 W/gel seguida de otra etapa de 5 horas a 20 W por gel hasta un máximo de 100 W.
Tabla 2.4. Programa de isoelectroenfoque utilizado para DIGE.
Paso Volta e (V) j Duración (h)*
1 300 4
2 300-1000 4
3 1000-8000 2
4 8000 3
* El voltaje total necesario para el enfoque de las proteínas es de 42000 Vh. Todas las tiras IPG se enfocaron a 0.05 mA/tira.
Una vez acabada la electroforesis, se obtuvieron las imágenes de fluorescencia para los fluorocromos Cy2, Cy3 y Cy5 a longitudes de excitación/emisión de 488/520, 532/580 y 633/670, respectivamente mediante el escáner Typhoon 9400 (GE Healthcare). Finalmente, las proteínas se visualizaron con un método de tinción visible siguiendo el protocolo de tinción de plata anteriormente descrito.
El análisis de las imágenes se llevó a cabo con el paquete informático DeCyder 5.01 (GE Healthcare). Primero, se utilizó el módulo DIA (DeCyder Differential In-Gel Analysis) para normalizar y codetectar las señales Cy2/Cy3/Cy5 de cada mancha resuelta en el gel. Asimismo, se realizaron las comparaciones entre las muestras PCOS vs Control para cada gel, calculándose los volúmenes normalizados por el patrón interno (Cy3:Cy2 ó Cy5:Cy2). Con el módulo BVA (DeCyder Biological Variation Analysis), se emparejaron las manchas detectadas en todos los geles y se calcularon los cambios en la abundancia relativa en las muestras PCOS con respecto a los controles, medida por la ecuación 3.4. Para valorar si los cambios detectados presentaban significancia estadística, se aplicó un test de la T no pareado entre los dos grupos (p-valor ≤ 0.05).
Abundancia relativa = Vol normalizado PCOS / Vol normalizado Controles (3.4)
El marcaje fluorescente de las muestras y la preparación de los geles correspondientes se realizaron en colaboración con la Unidad de Proteómica del Centro Nacional de Investigaciones Cardiológicas (Instituto de Salud Carlos III, Madrid).