Los métodos de agrupamiento facilitan el análisis de los perfiles de expresión y proporcionan información sobre la coexpresión de genes bajo una determinada condición. Con el fin de analizar las relaciones de coexpresión entre genes diferencialmente expresados en PCOS, se llevó a cabo un análisis de agrupamiento jerárquico. Tal como se muestra en la Figura 4.2, hemos obtenido varios grupos de genes coexpresados en dos grandes ramas, una conteniendo 6 grupos de genes sobreexpresados y otra con 4 grupos de genes reprimidos. Varias sondas del mismo gen y genes relacionados funcionalmente aparecen en el mismo grupo, lo cual nos da una idea de la fiabilidad de los patrones de expresión encontrados.
Partiendo de la asunción de que un grupo de genes coexpresados suelen presentar corregulación y que genes corregulados suelen compartir motivos similares de regulación, se buscaron elementos cis-reguladores que fueran comunes para los distintos grupos de coexpresión. En la Figura 4.2, se muestra de forma más detallada algunas de las asociaciones significativas encontradas entre grupos de genes coexpresados y la localización de sitios putativos de unión a factores de transcripción (TFBSs). Se han considerado sólo aquellos TFBSs que están sobrerrepresentados de forma significativa en la mayoría de los genes coexpresados.
Este análisis muestra una sobrerrepresentación estadísticamente significativa de sitios de unión para HNF4, FOXI1 y FOXA2, factores de transcripción previamente implicados en la patogénesis de la resistencia a insulina y DMT2 (Odom et al., 2004). FOXA2, también denominado HNF3β, regula la oxidación de ácidos grasos en el hígado durante los periodos de ayuno de forma dependiente de insulina (Wolfrum et al., 2003). Además, la actividad transcripcional de FOXA2 se encuentra inhibida en estados de resistencia a insulina (Wolfrum et al., 2004). Nuestros resultados indican que algunos genes reprimidos en las pacientes PCOS podrían ser dianas transcripcionales de FOXA2 (grupo I), lo que podría evidenciar un posible papel de FOXA2 en el PCOS asociado a las alteraciones en la función insulínica. Dentro de estos genes corregulados por FOXA2 se incluyen genes de actina y miosina, componentes del citoesqueleto que intervienen en el proceso de transporte de GLUT4 mediado por insulina en adipocitos (Watson et al., 2004).
Figura 4.2. Agrupamiento jerárquico de los genes desregulados en el tejido adiposo omental de pacientes PCOS (P1-8) y mujeres control (C1-7). Los genes se agruparon mediante el método de ligamiento
promedio en función a la semejanza encontrada entre sus patrones de expresión, medida por la correlación de Pearson. Se han incluido las 78 sondas de Affymetrix previamente seleccionadas por sus cambios significativos de expresión en las muestras PCOS. Las sondas y las muestras experimentales están distribuidas en filas y en columnas, respectivamente. Cada celda de la matriz de datos representa el valor en log2 del ratio de la abundancia de cada tránscrito con respecto a la mediana de la abundancia para dicho gen entre todas las muestras. Las intensidades crecientes en color verde indican una disminución de la expresión en las pacientes mientras que el aumento en la expresión viene indicado en rojo. A la derecha de la figura, se indican los agrupamientos génicos obtenidos (A-J), representados por barras verticales en distintos colores, junto con los factores de transcripción que presentan posibles sitios de unión sobrerrepresentados de forma significativa en cada grupo de genes coexpresados (p-valor < 0.05). Se indica el porcentaje de genes de cada grupo que presentan sitios de unión al correspondiente factor. a No significativo (p = 0.06).
De la misma manera, varios grupos génicos muestran una sobrerrepresentación para efectores transcripcionales de la ruta de señalización mediada por Wnt/ß-catenina, tales como TCF4, LEF1 y TCF1 (éste último en el grupo B, dato no mostrado en la figura 4.2). Es interesante destacar que el factor de transcripción TCF4 es uno de los genes con expresión aumentada en las pacientes con PCOS (Tabla 4.6). Entre las dianas transcripcionales que han sido identificadas por este trabajo in silico como posibles efectores de la ruta de Wnt, FGF9, CD44 y DKK1 habían sido previamente descritos como genes regulados por dicha ruta (Gonzalez-Sancho et al., 2005; Schwartz et al., 2003). También se ha observado que existe una sobrerrepresentación significativa de sitios de unión a Myc en los tres genes del grupo D y en un subgrupo muy homogéneo de genes en el grupo F. Myc es otro gen diana de la función transcripcional mediada por β-catenina/TCF, lo que puede indicar que el aumento en la expresión de genes regulados por Myc podría ser un efecto secundario a la activación de la ruta de Wnt/β-catenina en el tejido adiposo de pacientes PCOS.
Estos resultados indican que algunos de estos grupos de genes coexpresados comparten sitios de unión a factores de transcripción y, por tanto, presentan una regulación en común. La desregulación en su expresión podría ser un reflejo de posibles alteraciones en la función transcripcional de dicho factor. Sin embargo, tenemos que ser cautos con esta inferencia debido a varias razones. Primero, aunque el hecho de compartir unión a un determinado factor de transcripción es un buen indicio de corregulación (Park et al., 2002), la regulación transcripcional in vivo está influenciada por otros factores adicionales, puesto que otros correguladores, tanto activadores como represores, pueden estar modulando la acción de un determinado factor transcripcional. Por otra parte, en la localización de TFBSs en regiones genómicas de genes coexpresados se buscan secuencias patrón de pequeño número de bases y se utiliza un método estadístico para determinar el grado de significancia, de manera que si no se utiliza un control de falsos positivos lo suficientemente estricto, se podrían estar considerando falsos elementos cis-reguladores. Por todo ello, estos resultados de corregulación deben ser interpretados con cautela como nuevas hipótesis que podrían explicar la desregulación génica observada en el PCOS y que tendrán que ser verificadas con posterioridad.