Determinación de los términos ontológicos representados diferencialmente para cada uno de los fraccionamientos obtenidos. D. Representación gráfica de los términos significativos bajo el valor del estadístico para detectar distribuciones asimétricas de los genes. E. Ejemplo de la distribución de dos términos entre el conjunto de genes. El término marcado en azul se encuentra uniformemente distribuido mientras que el marcado en rosa se distribuye de forma asimétrica entre los genes con una acumulación en uno de los extremos de la lista (Adaptado de Al-Shahrour, 2005).
Figura 4.4. Términos de GO con mayor o menor representación en los genes diferencialmente expresados en las muestras con PCOS. A. Términos GO sobrerrepresentados significativamente en el
PCOS. B. Términos GO con menor representación en las muestras con PCOS o, a la inversa, sobrerrepresentados en las muestras control. La parte derecha del eje X se corresponde con mayores niveles de expresión en los pacientes con PCOS, medidos por el estadístico t. La parte izquierda del mismo eje representa aquellos genes más expresados en los controles. El eje Y representa la diferencia entre los porcentajes para los términos GO en la partición correspondiente. Se han representado únicamente los “enriquecimientos” con significancia estadística (Test de Fischer; p-valor ajustado < 0.05) para varios fraccionamientos del valor del estadístico.
Figura 4.5. Niveles de expresión de la familia génica GSTM en el tejido adiposo omental. Se indica
el valor medio de expresión de las ocho pacientes con PCOS y de las siete mujeres control para las sondas presentes en el array HG- U133A que codifican genes GSTM. En el caso de GSTM3, las pacientes con PCOS muestran un cambio significativo de expresión (ratio > 1.5). 0 100 200 300 400 500 GSTM3 GSTM1 GSTM2 GSTM4 GSTM5
Media PCOS Media CTRL
De igual manera, genes englobados en la función molecular denominada actividad aldo- keto reductasa presentan una mayor representación en las muestras con PCOS. Es interesante destacar que dentro de este término se engloban varios miembros de la familia de enzimas aldo-keto reductasas de tipo 1C (AKR1C), mediadoras de la interconversión entre hormonas esteroideas y, por tanto, con una importante función en la síntesis local de andrógenos y estrógenos activos a partir de esteroides inactivos. Entre ellos, el gen AKR1C3, que codifica a la enzima 17β-HSD de tipo 5, es el que muestra un mayor cambio en su expresión en las pacientes PCOS en comparación con las muestras control (ratio = 1.35). A pesar de que los cambios en su expresión sean modestos, pues, tal como se refleja en la representación gráfica (Figura 4.4A), el valor del estadístico es bajo, este análisis nos ha permitido encontrar cambios coordinados en la expresión de este grupo de genes relacionados funcionalmente, los cuales podrían jugar un papel en la fisiopatología del PCOS.
En la figura 4.4B, se muestran los términos con menor representación de genes en el fenotipo PCOS. Los valores negativos del estadístico se corresponden con genes con mayor expresión en el grupo control y unas diferencias negativas en los porcentajes significa que esos genes están más representados en las muestras control, es decir, menos representados en las pacientes con PCOS. Por lo tanto, el término respuesta inmune y, en particular, el término relacionado unión a antígeno están menos representados en los pacientes PCOS. Asimismo, los genes relacionados con funciones de adhesión celular, como los clasificados dentro de la actividad de unión a ácido hialurónico, componente estructural de matriz extracelular y unión a colágeno se pueden considerar que están reprimidos en PCOS.
Las observaciones recogidas con este método son consistentes con los resultados del análisis ontológico realizado exclusivamente con los genes identificados como
diferencialmente expresados en el PCOS. En resumen, se podría decir que existe una activación de oxidorreductasas en los pacientes PCOS (término GO actividad oxidorreductasa), incluyendo las actividades aldo-keto reductasa, cytocromo b5-reductasa y una actividad oxidorreductasa
actuando sobre grupos donadores de sulfuros. Estos dos últimos términos presentan significancia estadística para una sola partición (datos no mostrados). Por otro lado, se observa una tendencia a que procesos relacionados con respuesta inmune y comunicación celular estén atenuados en el fenotipo PCOS. Además de confirmar estos resultados, el análisis de “enriquecimiento” de genes nos ha permitido encontrar cambios consistentes en la expresión de grupos de genes relacionados funcionalmente, genes con actividad aldo-keto reductasa y genes de la familia GSTM; cambios que de otra manera hubieran pasado desapercibidos. Los modestos cambios de expresión no permiten el que estos genes destaquen como significativos en los tradicionales análisis de microarrays. Sin embargo, independientemente de la magnitud del cambio, cambios coordinados en la expresión de un grupo de genes relacionados pueden tener una significancia biológica en la patología.
A pesar del auge de las técnicas de microarrays en los últimos años, existen todavía aspectos a mejorar para llegar a un consenso que permita una mayor integración de los resultados obtenidos por distintos grupos de investigación. Algunas de estas cuestiones son de carácter técnico y otras versan sobre los programas bioinformáticos necesarios para analizar de forma apropiada la información generada, pues el resultado final depende, en gran medida, del tratamiento estadístico de los datos. Las diferencias técnicas entre las distintas plataformas provoca que no existan protocolos de análisis estandarizados de modo que las estrategias a seguir, los criterios y los métodos de análisis varían de unos trabajos a otros, lo que dificulta la comparación de los resultados.
El empleo de muestras humanas añade limitaciones adicionales en el diseño y análisis estadístico de los microarrays, las cuales están relacionadas con la heterogeneidad genética de los individuos y con el limitado número de muestras de las que normalmente se dispone. Además, cuando el objeto de estudio del análisis con microarrays es una enfermedad compleja, como en el trabajo aquí expuesto, hay que sumar los problemas asociados a la heterogeneidad de las manifestaciones clínicas (Miklos & Maleszka, 2004; Mootha et al., 2003; Patti et al., 2003). Otra variable de confusión que puede afectar a la interpretación de un estudio de microarrays es la heterogeneidad del tejido. En trabajos recientes, se ha visto que la variación debida a las diferentes poblaciones celulares en una biopsia de tejido humano puede exceder la variabilidad interindividual (Bakay et al., 2002). La solución a este problema consistiría en
aislar los distintos tipos celulares que forman el tejido adiposo mediante microdisección por láser y estudiar su perfil de expresión génica por separado, pero desafortunadamente no hemos podido disponer de esta tecnología.