LETALIDAD 4/4 4 ratones
/peso 20 g Tiempo de muerte: 18 horas CULTIVO 1.5 L No aplica Medio de cultivo: Caldo
Clostridium CONCENTRACIÓN
DE TOXINA AδFA (α) Volumen 500 ml obtenido No aplica Cultivo concentrado 3 veces por ultrafiltración tangencial, inactivación con formaldehído 0.5%, adyuvante: hidróxido de aluminio 3%
DL50 1/64 Ratón Método de Reed
Müench
TITULACIÓN
TOXINA Toxina alfa (UIT/ml α): 8 Ratón Titulación realizada en la dilución 1/64, vía de inoculación
intraperitoneal 0.5 ml TEST DE
NEUTRALIZACIÓN Preparado antigénico: 4 UIA/ml Ratón Antitoxinas por la vacunación con el inducidas preparado antigénico
61 Tabla 20. Resultados de los estudios realizados al aislamiento C. perfringens 009. Incluye letalidad en ratones 4/4 muertos en 14 horas, volumen del cultivo 500 ml, concentración de toxina (α) a 125 ml (3 veces), DL 50 en ratones 1/128, titulación de toxina alfa (α) en 10 UIA/ml y un test de neutralización con el preparado antigénico de 6 UIA/ml. La especificación de los biológicos que contiene toxoide alfa de C. perfringens es de mínimo 4 UIA/ml.
AISLAMIENTO 009
ENSAYO RESULTADO MODELO
BIOLÓGICO OBSERVACIONES
LETALIDAD 4/4 4 ratones
/peso 20 g Tiempo de muerte: 14 horas CULTIVO 500 ml No aplica Medio de cultivo: Caldo
Clostridium CONCENTRACIÓN
DE TOXINA AδFA (α) Volumen 125 ml obtenido No aplica Cultivo concentrado 3 veces por ultrafiltración tangencial, inactivación con formaldehído 0.5%, adyuvante: hidróxido de aluminio 3%
DL50 1/128 Ratón Método de Reed
Müench
TITULACIÓN
TOXINA Toxina α: 10 UIT/ml Ratón Titulación realizada en en la dilución 1/128, vía de inoculación
intraperitoneal 0.5 ml TEST DE
NEUTRALIZACIÓN Preparado antigénico: 6 UIA/ml Ratón Antitoxinas por la vacunación con el inducidas preparado antigénico
El test de neutralización mostro que el preparado antigénico indujo la producción de antitoxinas, las cuales se expresan en UIA (unidad internacional de antitoxina), la unidad internacional mide la actividad de la antitoxina en ser capaz de neutralizar cierta cantidad de toxinas.
62
7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Las enfermedades cuyo agente etiológico es C. perfringens son causa de muerte en diversas especies animales como bovinos, ovinos, porcinos y equinos. Como un método preventivo se emplean biológicos que contienen Clostridium perfringens elaborados con cepas de referencia internacional obtenidas de bancos de microorganismos reconocidos. Actualmente, no es viable adquirir bacterias del genero Clostridium en estos centros de referencia por ser consideradas cepas con fines bioterroristas, lo que lleva a considerar los aislamientos de campo como una opción. Este trabajo permitió demostrar que se pueden elaborar preparados antigénicos con microorganismos aislados de campo a partir de animales enfermos y con sintomatología característica de enfermedades producidas por C. perfringens.
Los resultados mostraron que los microorganismos recuperados a partir de las muestras de intestino y materia fecal obtenidas a partir de animales con sintomatología característica de enterotoxemía como cólicos, distención abdominal, diarrea, y analizados empleando medios de cultivo enriquecidos y diferenciales fueron positivos para C. perfringens, llegando a obtenerse cinto (5) aislamientos productores de toxinas confirmados en su género y especie por morfología macroscópica observándose al crecer en agar bajo condiciones anaerobias colonias características con forma de huevo frito, de aspecto rugoso y de color blanco, la morfología microscópica mostro bacilos Gram(+) con espora ovalada subterminal para los cinco (5) aislamientos. Las colonias obtenidas en agar sangre mostraron hemolisis positiva beta lo que indica una hemolisis completa de los glóbulos rojos producida por la toxina alfa (α) y en agar yema de huevo se observo alrededor de las colonias una zona opalescente característica donde la acción de la toxina hace que el lípido P de la yema de huevo se descomponga en un componente insoluble y la lecitina en fosforilcolina y diglicerido. Esta descomposición de la lecitina hace que se observe este color claro (similar a la crema) ya que la lecitina actúa como un agente estabilizante en la emulsión proteína y grasa la cual se rompe por acción de la toxina alfa (α). La producción de las toxinas también esta asociada a la composición del medio de cultivo donde la carne incluida en el medio aporta proteínas libres solubles en agua que induce al microorganismo a producir las toxinas. La producción de gas (H2 y CO2) en medio de carne fue un indicio de su metabolismo anaerobio.
63 Los microorganismos aislados fueron codificados como C. perfringens 001, 006, 007, 008 y 009 para mantener una trazabilidad en el laboratorio y conservados congelados en un congelador de ultrabaja a -60°C. Para poder elaborar el preparado antigénico fue necesario investigar el grado de producción de toxinas de los aislamientos realizando estudios biológicos en animales de laboratorio ya que si los aislamientos no eran productores de toxinas no podían ser empleados para la elaboración del preparado antigénico, así, se realizaron cultivos en un medio especial para anaerobios (caldo de carne), se separaron los sobrenadantes los cuales fueron inoculados en ratones llegando a evidenciarse letalidad y tiempos de muerte menores a 30 horas en los 5 aislamientos y la cepa de referencia (C. perfringens ATCC 3628), los aislamientos 001 y 009 presentaron tiempos de muerte de 16 y 14 horas respectivamente, los aislamientos 006, 007 y 008 presentaron tiempos de 24, 26 y 20 horas, respectivamente, la letalidad es producida por las toxinas que se diseminan por la sangre llegando a los órganos (toxemia) produciendo muerte súbita, este resultado se concluyó que los aislamientos 001 y 009 presuntivamente eran productores de mayor cantidad de toxinas por el menor tiempo de muerte. Para determinar que toxinas fueron la causa de la letalidad y poder llegar a clasificar los aislamientos en serotipos se procedió a estudiar si las toxinas evidenciadas en las pruebas de letalidad correspondían a alguna(s) de las toxinas mayores producidas por C. perfringens realizando un análisis molecular que incluyó SDS PAGE y ELISA a los aislamientos 001, 007, 008, 009 y la referencia 3628, no se incluyó el aislamiento 006 porque fue el que tuvo el tiempo de letalidad más largo (24 horas) es decir, menor producción de toxinas, lo que podría implicar más adelante que el proceso de elaboración del preparado antigénico no fuera eficiente. Las bandas obtenidas para los aislamientos 001 y 009 comparados con la referencia tuvieron pesos moleculares entre 44 y 41 kDa lo que está de acuerdo con lo que reporta la literatura para las toxinas alfa y beta de C. perfringens 40 y 43 kDa, respectivamente. Durante el proceso de concentración se retuvieron las proteínas con peso molecular mayor a 10 kDa, lo que incluía las toxinas de C. perfringens, al comparar las bandas con la escala de peso molecular se encontraron dos bandas que salieron entre los marcadores 37 y 50 kDa correspondientes a las toxinas alfa (α) y beta (β). Para confirmar la identidad de las toxinas se llevó a cabo una prueba de ELISA donde los resultados de absorbancia y colorimétricos confirmaron la presencia de la toxina alfa (α) en todos los aislamientos estudiados y la toxina beta (β) en los aislamientos 001 y 009, la cepa de referencia 3628 (C. perfringens tipo C) produjo las dos
64 toxinas. En la prueba de Elisa la placa se encontraba sensibilizada con las antitoxinas correspondientes a las producidas por C. perfringens (alfa, beta y épsilon) así como para el microrganismo, el resultado mostro que en los aislamientos seleccionados la reacción toxina – antitoxina fue evidente para las toxinas alfa (α) y (β) y para el microorganismo, Este resultado permitió concluir que los aislamientos 001 y 009 correspondían a C. perfringens tipo C.
Con los estudios anteriores ya se tenía claro cuales aislamientos eran los que cumplían con el objetivo del trabajo en cuanto a producción de toxinas alfa (α) y beta (β). Para decidir cuál de los dos aislamientos emplear en la producción del preparado antigénico se tuvo en cuenta la concentración de microorganismos obtenidos en cada cultivo con base en la cinética de crecimiento, así el aislamiento 009 presentó una velocidad de crecimiento de 0.33 min contra 0.06 min del aislamiento 001, y un tiempo de generación de 89 minutos contra 4.9 horas, respectivamente, adicionalmente los resultados de las curvas de crecimiento evidenciaron que el aislamiento codificado como 009 alcanzó una concentración de 4,44 x 107 ufc/ml y el aislamiento codificado como 001 alcanzó una concentración de 1,20 x 106 ufc/ml en relación con los resultados obtenidos en la prueba de letalidad. Adicionalmente se debe tener en cuenta que la toxina alfa (α) es una exotoxina que se produce en la fase logarítmica por lo que se puede pensar que el aislamiento 009 que presento mayor crecimiento produjo más toxina que el aislamiento 001. Esta diferencia en el crecimiento permitió seleccionar el aislamiento 009 de C. perfringens clasificado como tipo C como el microorganismo con el cual se iba a elaborar el preparado antigénico. Adicionalmente se definió solamente continuar el estudio con la toxina alfa (α) por las pruebas biológicas que se requerían para evidenciar su capacidad de inducción de anti-toxinas y por ser la toxina común a los 5 tipos de Clostridium. La toxina beta (β) se planteó como un valor agregado al preparado antigénico a la cual se le puede realizar el estudio antigénico como inductora de anti-toxinas en futuras investigaciones. A partir del cultivo del aislamiento 009 productor de toxinas se obtuvo el preparado antigénico como se indicó en la metodología el cual fue evaluado para producción de antitoxina alfa (α) en animales de laboratorio empleando el test de neutralización. El preparado antigénico o toxoide se elaboro mediante la adición del reactivo químico formaldehido el cual produce una polimerización en las proteínas de la toxina reaccionando con el grupo amino del aminoácido N - terminal y las cadenas
65 laterales de los aminoácidos arginina, cisteína, histidina y lisina inactivando las toxinas pero conservando sus características antigénicas.
Los resultados confirmaron que el preparado antigénico elaborado con el aislamiento 009 comparado con una cepa de referencia de C. perfringens tipo C indujo protección en los conejos ya que neutralizó la cantidad de toxina alfa (α) que produciría enfermedad con un título de 6 UIA/ml y 4 UIA/ml para la referencia,
El estudio permitió concluir que es factible obtener cepas nativas de C. perfringens tipo C a partir de muestras de animales con sintomatología típica de enterotoxemia que al ser bien caracterizadas, pueden emplearse para la elaboración de productos biológicos que inducen protección contra las enfermedades producidas por este microorganismo a nivel de campo, que el toxoide sería específico para la zona de donde se realizó el aislamiento y se emplearía en las especies animales recomendadas como son bovinos, ovinos, porcinos equinos. En este estudio particular el preparado antigénico de toxina alfa (α) puede inducir protección contra la fracción de la toxina alfa (α) de C. perfringens tipo C, pero no se debe olvidar que los tipos A, B, D y E también son cepas productoras de toxina alfa (α), entre otras, y son causantes de enfermedades a nivel veterinario, lo que lleva a afirmar que el preparado de toxina alfa (α) puede inducir protección contra los 5 tipos de Clostridium debido a la homología presentada en la secuencia genética. Se debe tener en cuenta que el concentrado obtenido tiene la toxina beta (β), la cual no fue evaluada en este estudio pero que seguramente al aplicar el test de neutralización se evidenciaría antitoxina beta (β)
Los resultados obtenidos llevan a concluir que los aislamientos de cepas de campo pueden ser una solución para los laboratorios que deseen fabricar biológicos y no tengan acceso a obtener las cepas en centros de referencia internacional, ya que el campo en la investigación de aislamientos de campo ofrece amplias posibilidades para contar con productos biológicos puros, seguros y efectivos.
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70 ANEXOS
ANEXO 1. Procedimiento:
MANEJO DE LA ALIMENTACIÓN DE LOS ANIMALES DEL BIOTERIO