La respuesta inmune celular del hospedero es crucial para el control de infecciones causadas por patógenos intracelulares. En la infección por T. cruzi, se ha descrito que los LT CD8+ juegan un papel importante en la infección aguda y crónica mediante la secreción de citoquinas y la actividad citotóxica (Tzelepis et al., 2006). Los LT CD8+ son un compartimento celular heterogéneo compuesto por subpoblaciones con diferentes grados de diferenciación y actividad funcional (Mahnke et al., 2013). Las subpoblaciones de LT CD8+ han sido ampliamente estudiadas en modelos de infección crónica causadas por virus, sin embargo, poco se conoce en infecciones causadas por protozoos intracelulares como T. cruzi. En el presente trabajo se realizó la comparación de las subpoblaciones de LT CD8+ totales y específicos de T. cruzi: TSCM,
TCM, TTM, TEM y TTE en cuanto a frecuencia y actividad funcional entre PCC con
diferentes estados de gravedad de la enfermedad. Análisis que contribuye a entender la inmunidad celular durante el desarrollo de la fase crónica y la patogénesis de la enfermedad de Chagas.
Nuestros hallazgos muestran que los pacientes con formas más graves de la enfermedad de Chagas presentan una menor frecuencia de LT CD8+ con estados tempranos de diferenciación. En estos pacientes no se detectó TSCM productores de
IFN-, TNF-α o IL-2. Con respecto a la actividad multifuncional, se observó que frente al estímulo policlonal, las células de los PCC tienen un comportamiento similar a las células de los CS en cuanto a la producción de 1, 2 o 3 citoquinas. En contraste, frente al estímulo con antígenos de T. cruzi, se observó pérdida de la multifuncionalidad en los estados más graves de la enfermedad. De hecho, los TCM, TEM y TTE de los pacientes
con estados más graves de la enfermedad llevan a cabo solo una función proporcionalmente distribuida entre las células productoras de IFN- y TNF-.
A la fecha, se han propuesto distintos modelos de diferenciación que explican el origen de las subpoblaciones de LT CD8+ de memoria. Así, el modelo llamado
plantea la generación de LT de memoria con características similares a las células madre, el cual permite la generación de células efectoras encargadas de eliminar el antígeno (Ganusov, 2007; Restifo et al., 2013). Recientemente, los TSCM CD8+ fueron
identificados como una población temprana con una alta capacidad de autorenovación y proliferación, capaz de diferenciarse en las otras subpoblaciones de memoria como los TCM y TEM (Gattinoni et al., 2011).
Algunos modelos indican la importancia de los TSCM o con características similares en
el control de la infección y desarrollo tumoral. En un modelo murino de infección por Listeria monocytogenes se ha mostrado que la transferencia adoptiva de LT que expresan altos niveles de CD127 contribuye al control de la infección ya que estas células promueven la generación de células efectoras que son responsables de eliminar la bacteria presente en el bazo e hígado (Kaech et al., 2003). Dado que los TSCM expresan altos niveles de CD127, así como otras moléculas asociadas a la
diferenciación temprana como CD45RA, CCR7, CD28 y CD27 (Gattinoni et al., 2011), se sugiere que estas células pueden estar implicadas en el control de patógenos intracelulares. De manera interesante, se ha propuesto la utilización de TSCM en
inmunoterapia para el tratamiento del cáncer debido a que en modelos murinos tumorales la transferencia adoptiva de estas células induce una mayor regresión del tumor comparado con la transferencia de TCM o TEM (Gattinoni et al., 2011).
La inmunidad protectora se ha asociado con la habilidad que tienen los LT CD8+ de memoria para sobrevivir por largos periodos de tiempo, evento relacionado con la expresión de altos niveles de moléculas anti-apoptóticas (Grayson et al., 2000), la capacidad de proliferar independiente del estímulo antigénico mediante citoquinas homeostáticas como IL-7 e IL-15 (Surh et al., 2008) y la rápida diferenciación a células efectoras. Los TSCM, se han descrito como una población de larga vida capaz de
proliferar frente al estímulo de citoquinas homeostáticas (Gattinoni et al., 2011). Además, en un modelo de infección viral crónica en primates no humanos, se encontró que los TSCM tienen una mayor capacidad de sobrevivir por largos periodos
de tiempo en presencia o ausencia del antígeno comparado con los TCM y TEM (Lugli et
al., 2013). Estos hallazgos sugieren un importante papel de los TSCM en el control de
infecciones crónicas, sin embargo, el papel de esta subpoblación celular en infecciones crónicas se desconoce.
En la infección crónica por T. cruzi se ha encontrado que pacientes con formas graves de la enfermedad de Chagas presentan una menor frecuencia de LT CD8+ con un estado de diferenciación temprano al comparar con pacientes con formas menos graves de la enfermedad (Albareda et al., 2006), sugiriendo que estas células podrían estar involucradas en el control de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, la aproximación metodológica para determinar las subpoblaciones de LT CD8+ hasta el momento, solo ha permitido evaluar los TCM y TEM en modelos murinos (Bixby et al.,
2008; Bustamante et al., 2008) y humanos (Albareda et al., 2006; Lasso et al., 2010), pero no otras subpoblaciones como los TSCM. Este trabajo es el primer estudio de los
TSCM específicos de T. cruzi en PCC y si bien subpoblaciones como TCM y TEM se han
evaluado previamente, este estudio muestra el panorama completo de las subpoblaciones en los PCC con distintos estados de gravedad de la enfermedad. Los TSCM pueden representar la subpoblación celular que mantiene el pool de
progenitores que se requiere para mantener una respuesta frente al parásito, probablemente más eficientes que las otras subpoblaciones de memoria, ya que los TSCM comparados con los TCM, son capaces de generar TCM, TEM y TTE y estas
subpoblaciones no tienen la capacidad de diferenciarse en los TSCM (Gattinoni et al.,
2011; Lugli et al., 2013).
La calidad de la respuesta de los LT involucra no solo la frecuencia de las células, sino también la eficiencia de la respuesta, medida por la capacidad que tienen las células de producir más de una citoquina. Teniendo en cuenta que la respuesta linfoide tipo 1 se ha considerado de especial importancia en la infección por T. cruzi (Tarleton et al., 2000), se evaluó la producción de IFN-, TNF-α e IL-2 en las subpoblaciones celulares.
subpoblaciones de LT CD8+ permite evaluar la multifuncionalidad de acuerdo con lo descrito previamente (Seder et al., 2008).
En infecciones crónicas causadas por virus, la calidad de la respuesta de los LT CD8+ se ha asociado con el control de la progresión de la enfermedad (Seder et al., 2008). Así, se ha reportado que pacientes con infección crónica por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que no progresan al síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA), tienen una alta frecuencia de LT CD8+ multifuncionales comparado con los pacientes con infección por el VIH que si progresan al SIDA, los cuales muestran una alta frecuencia de células monofuncionales (Betts et al., 2006). En la infección por el protozoo Leishmania major, la multifuncionalidad de los LT se ha propuesto como un correlato de protección, ya que en un modelo murino de infección se encontró que la actividad multifuncional de los LT especializados en la producción de IFN- y TNF-α se
asocia con menor tamaño de la lesión y menor parasitemia (Darrah et al., 2007). De acuerdo con estos resultados, en el presente trabajo se encontraron células productoras de 2 citoquinas como IFN- y TNF-α e pacie tes co fo as e os
graves de la enfermedad, sugiriendo que la producción conjugada de estas citoquinas podría evitar la progresión a las formas más graves de la enfermedad.
En modelos de infección crónica en ratones, se ha propuesto que un factor importante se relaciona con la pérdida progresiva de funciones efectoras de los LT, fenómeno conocido como agotamiento clonal (Barber et al., 2006), en humanos se ha descrito en la infección crónica por el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Bengsch et al., 2010; Day et al., 2006). El agotamiento inicia con la pérdida de la producción de IL-2, seguido por la de TNF-α y por último, la pérdida de la producción de IFN- e inclusive puede ocurrir apoptosis celular (Wherry, 2011). En la infección crónica por T. cruzi se ha propuesto que la persistencia antigénica promueve el agotamiento de los LT, lo cual puede contribuir a la progresión de la enfermedad (Albareda et al., 2013; Albareda et al., 2006; Laucella et al., 2004). En PCC adultos se ha reportado que la respuesta de los LT CD4+ frente al
parásito es en su mayoría monofuncional con producción de IFN- y ausencia de células productoras de TNF-α (Albareda et al., 2013). En el presente trabajo se encontró que los PCC tienen LT CD8+ monofuncionales productores de IFN- o TNF-α. El papel de estas citoquinas en la patogenia de la enfermedad de Chagas es controversial, ya que en algunos estudios se reporta que los PCC con formas severas de la enfermedad muestran una alta frecuencia de células productoras de IFN- (J. A. Gomes et al., 2003) y de niveles de TNF-α en sangre (Talvani et al., 2004), sin embargo, otros estudios muestran lo contrario respecto de células productoras de IFN- (Laucella et al., 2004) y niveles sanguíneos de TNF-α (Pérez-Fuentes et al., 2003).
Uno de los aspectos importantes en la evaluación de la inmunidad en infecciones crónicas, es determinar si las alteraciones de la respuesta inmune se presentan solo en células específicas de antígeno o en general afectando diferentes clones linfoides. En pacientes con infección por el VIH se ha encontrado que el estado de diferenciación y la multifuncionalidad de LT CD8+ están alterados solo en células específicas para VIH pero no en células específicas para citomegalovirus (CMV) (Riou et al., 2012). En el presente trabajo, tanto en PCC como en CS, se encontró que las células estimuladas con SEB producen 1, 2 o 3 citoquinas, independiente del estado de diferenciación celular y del estado de gravedad de la enfermedad de los PCC. Previamente, se ha demostrado que los LT CD8+ de PCC son capaces de responder frente a un antígeno del virus de la influenza similar a lo observado en los CS (Lasso et al., 2012). Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que los PCC no presentan una alteración de la actividad funcional generalizada frente a otros patógenos.
Con respecto a la carga antigénica, se ha mostrado, en un modelo murino de infección por T. cruzi, que después del tratamiento anti-parasitario con benznidazol, la eliminación de la carga parasitaria en los ratones se asocia con una alta frecuencia de células con diferenciación temprana como los TCM (Bustamante et al., 2008). Esto
en la distribución de las subpoblaciones celulares en la enfermedad de Chagas. Debido a esto, en el presente trabajo se evaluó la parasitemia utilizando PCR convencional y PCR cuantitativa. Teniendo en cuenta que durante la infección crónica por T. cruzi la parasitemia es baja (Britto, 2009), en este trabajo se amplió la posibilidad de detectar el ADN circulante del parásito mediante el uso de las dos PCR, ya que utilizan blancos de amplificación diferentes, la región variable del minicírculo del ADNk (Sturm et al., 1989) y una región de ADN satélite de T. cruzi (Piron et al., 2007), respectivamente. Si bien, en nuestro caso se detectó ADN del parásito en sangre periférica en el 40% de los PCC, es de especial importancia resaltar que hubo detección incluso en pacientes con mayor estado de gravedad de la enfermedad. Además, teniendo en cuenta que el tropismo del parásito es a tejido cardiaco, existe una alta probabilidad de que inclusive en los pacientes en quienes no fue posible detectar el antígeno en sangre, lo presenten en el corazón (Marcon et al., 2011). De acuerdo con lo anterior, resultados de un estudio paralelo de nuestro grupo de investigación muestran que la pérdida de la multifuncionalidad en pacientes con formas graves de la enfermedad se asocia con el incremento de receptores inhibitorios en LT CD8+ de PCC (Manuscrito en preparación). Considerando estos hallazgos y la persistencia del parásito observada en los PCC, se propone que los LT CD8+ de PCC se encuentran en un proceso de agotamiento, lo cual puede contribuir a la progresión de la enfermedad y al desarrollo de la patología.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo se propone que un escenario posible para la infección por T. cruzi es que durante la infección aguda ocurre una intensa activación de la respuesta inmune que contribuye al control de la replicación del parásito. La persistencia del antígeno genera una activación constante de la inmunidad adaptativa que en algún momento conlleva a un desbalance de la respuesta inmune específica y progresión de la enfermedad a estados graves, donde hay pérdida de la población celular de progenitores tempranos (TSCM), aumento en la
Figura 10. Modelo de las subpoblaciones de LT CD8+ en PCC. Representación de la proporción de TSCM, TCM, TEM y TTE CD8+ totales y específicos de T. cruzi en los PCC con
diferentes estados de gravedad de la enfermedad. Las barras negras representan la actividad funcional evaluada en las subpoblaciones de LT CD8+ totales y específicos de T. cruzi, cuando fueron estimulados con el lisado de tripomastigotes de T. cruzi.
9. CONCLUSIÓN
Los pacientes con enfermedad de Chagas en estados A, B y C presentan células TSCM
CD8+ con una y dos funciones. En contraste, los pacientes con estados más graves de la enfermedad (D) no presentan niveles detectables de células TSCM productoras de
IFN-, TNF-α e IL-2. Además, a mayor estado de gravedad de la enfermedad se encuentran LT CD8+ monofuncionales con mayor grado de diferenciación.
10.PERSPECTIVAS
Evaluar el papel de los TSCM específicos de T. cruzi y de los LT CD8+ multifuncionales
en el control de la progresión de la enfermedad de Chagas.
Identificar los mecanismos involucrados en el mantenimiento de los TSCM CD8+
específicos de T. cruzi durante el desarrollo de la enfermedad de Chagas.
Analizar las subpoblaciones de LT CD8+ en pacientes con enfermedad de Chagas antes y después del tratamiento anti-parasitario.
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