Junto con la piel, el bazo y el timo son órganos especialmente susceptibles de experimentar envejecimiento prematuro, como además el promotor de K5 dirige la
expresión del transgén a estos órganos, realizamos un estudio histológico de los mismos. El análisis del bazo de los ratones K5-CYLDC/S a diferentes edades, desde los 3 hasta los 16 meses, mostró importantes alteraciones morfológicas: a los 3 meses de edad, los defectos consistían en una microestructura anormal del parénquima esplénico, en donde se observaba que a diferencia del bazo de los ratones Control, en los que los folículos de células B y T que forma la pulpa blanca están densamente empaquetados, el bazo de los ratones transgénicos mostraba folículos de células B escasamente definidos, con hiperplasia marginal (Figura 19A-B). En los ratones K5- CYLDC/S viejos, de 16 meses de edad en adelante, se detectó una hiperplasia de la pulpa blanca que velaba la pulpa roja (comparar Figura 18C- D) así como áreas de atrofia de los folículos esplénicos (Figura 19F), con abundantes macrófagos e histiocitos. Estas alteraciones se producen en el envejecimiento fisiológico y no se observaron en ratones Control de la misma edad. Por tanto, el hecho de que estos cambios en el bazo se manifiesten en los ratones transgénicos desde los 3 meses de edad está indicando una senescencia prematura, ya que no se detectaron en los ratones Control hasta los 24 meses de edad. Estas alteraciones fenotípicas del bazo se encontraron en ambas líneas de ratones transgénicos (K5-CYLDC/S-X y K5- CYLDC/S-A). El análisis por INHQ con el anticuerpo específico de CYLD mostró que el transgén se expresaba en el bazo de los ratones transgénicos siguiendo el patrón de expresión de K5 en este órgano, es decir, se detectaba en las trabéculas del músculo liso y en las células reticulares (Figura 19G-I), tal como se había descrito anteriormente que era la expresión de K5 en bazo204. El análisis por WB con anticuerpos específicos de CYLD y de HA, confirmó la expresión del transgén en el bazo de los animales K5-CYLDC/S (Figura 19J). Posteriormente analizamos la vía de NF-κB por ver si al igual que ocurría en la piel, también se encontraba sobreactivada en los bazos de los ratones transgénicos y encontramos que efectivamente, presentaban mayores niveles de P-p65, lo que sugiere que éste es también el mecanismo más probable del envejecimiento acelerado del bazo en los ratones K5- CYLDC/S El análisis por INHQ con los anticuerpos específicos de B220 (Figura 19A, B) y CD3 (Figura 20C, D), que reconocen linfocitos B y T respectivamente, en el bazo de ratones Control y transgénicos, mostró la hiperplasia y la desorganización de los folículos linfoides en los transgénicos, mientras que en los ratones Control de la misma edad se mantenía la estructura.
A continuación, analizamos el timo de ratones Control y transgénicos a diferentes edades y encontramos que a partir de los 2,5 meses de edad los ratones K5-CYLDC/S mostraban importantes alteraciones histológicas, que consistían principalmente en una expansión del área cortical y una reducción de la región medular (comparar Figura 21A, B); a los de 3,5 meses de edad los ratones K5-CYLDC/S mostraron signos de involución del timo, con atrofia e infiltración de células adiposas a expensas del tejido tímico (Figura 21D). Esta es una involución prematura, ya que no se detectó en ratones Control de la misma edad. El análisis por INHQ y por Western blot mostró que el transgén se expresaba en la médula del timo de los ratones K5-CYLDC/S, coincidiendo con el patrón de expresión de K5 (Figura 21E-G, H). Además comprobamos que al igual que ocurría en la piel y en el bazo, en el timo de los ratones K5-CYLDC/S la vía de NF-κB estaba sobreactivada (Figura 21H), lo que podría explicar el envejecimiento acelerado de este órgano en los ratones transgénicos.
Figura 19. Caracterización histológica y bioquímica del bazo de ratones Control y transgénicos. (A- F) Imagenes histológicas representativas del bazo de ratones Control (A, C, E) y transgénicos (B, D, F) de
3 y 16 meses de edad. h: hiperplasia de la pulpa blanca (B, D). (G, H) Análisis por INHQ de la expresión de CYLD en ratones Control y transgénicos. (I) Inmunotinción con K5 y Sma (actina de músculo liso) en los ratones Control. (J) Análisis por WB del transgén en extractos proteicos de bazo. HA no se expresa en
los ratones Control. (K) Sobreactivación de NF-κB (P-p65) en los ratones K5-CYLDC/S. b, pulpa blanca. r,
Figura 20. Análisis de la expresión de marcadores linfocitarios en el bazo de ratones Control y transgénicos. (A, B) Tinción específica con B220 específica de linfocitos (C, D) Tinción específica con
CD3 para el reconocimiento de los linfocitos T. Barra de escala: 200 µm.
Figura 21. Caracterización histológica y bioquímica del timo de ratones Control y transgénicos. (A, B) A los 2,5 meses de edad el timo de los ratones transgénicos muestra expansión de la zona cortical y
reducción de la medular. (C, D) Imagen representativa de la atrofia del timo e infiltración de tejido adiposo blanco en ratones transgénicos de 3,5 meses de edad. (E-G) Análisis de la expresión del transgén mediante INHQ con el aniticuerpo especifico del tag HA. Se observa la expresión del trangén en la médula del timo de los animales K5-CYLDC/S (F), siguiendo el patrón de expresión de K5 (G), mientras que no se detecta en los controles (E). (H) Análisis por WB de la expresión del transgén en extractos proteicos de timo. Nótese la sobreactivación de NF-κB (niveles incrementados de P-p65) en los ratones
transgénicos. m, médula. c, corteza. a, tejido adiposo. Barras de escala: 500 µm (D); 350 µm (G); 300 µm
7. Los ratones K5-CYLDC/S presentan inflamación y envejecimiento