alteraciones físicas además de la alopecia, por ejemplo, presentaban una postura anómala caracterizada por el arqueamiento de la columna vertebral, cifosis (Figura 13). Estas características hacían pensar que los ratones K5-CYLDC/S podían tener un envejecimiento prematuro. Para comprobar si esto era así, se analizó la existencia de otros posibles signos de envejecimiento en los animales K5-CYLDC/S. Se estudió por análisis histológico la piel de ratones Control y transgénicos a distintas edades, al ser este órgano uno de los primeros en los que se manifiestan los síntomas de envejecimiento. Al mes de edad, además del retraso en la entrada en la segunda telogén de los FP (Figura 14A, B), los ratones K5-CYLDC/S presentaban otras alteraciones, por ejemplo, frente a las glándulas sebáceas pequeñas formadas por 3-4 adipocitos maduros que mostraban los ratones Control, los transgénicos exhibían hiperplasia de las glándulas sebáceas, con 6-8 adipocitos maduros. Además la epidermis interfolicular de los ratones K5-CYLDC/S tendía a ser más delgada y se observaban en ella regiones de picos de queratinocitos (Figura 14B-E). A los 3 meses de edad, el fenotipo de los ratones K5-CYLDC/S es más evidente, los picos epidérmicos eran más frecuentes y más acusado el adelgazamiento de la epidermis interfolicular; muestraban también mayor número de glándulas sebáceas hiperplásicas y huérfanas (Figura 14G-I). A continuación se analizó la piel del lomo y de la cola de ratones más viejos de ambos genotipos y se comprobó que el fenotipo cutáneo iba empeorando con el envejecimiento. A los 8 meses de edad, los ratones K5-CYLDC/S mostraban glándulas sebáceas huérfanas más abundantes y con mayor número de células grasas maduras (entre 8 y 12); la epidermis era más delgada que la de los ratones transgénicos más jóvenes (comparar Figura 14B-C con Figura 15B-C) y la alopecia más aparente. A los 20 meses los ratones K5-CYLDC/S presentaban un fenotipo muy prominente, con extensas áreas de epidermis interfolicular atrófica, formadas por una sola capa de queratinocitos (Figura 15I-K), en marcado contraste con la piel de los ratones Control de su misma edad, cuya epidermis estaba formada por una capa de queratinocitos basales y 1 o 2 capas de queratinocitos suprabasales (Figura 15H). También se encontró en estos ratones transgénicos más viejos una importante reducción en el número de FP, lo que daba lugar a una alopecia más generalizada y a la aparición de más abundantes glándulas sebáceas hiperplásicas y huérfanas, que aparecían agrupadas en la dermis (Figura 15K). Por el contrario, los FP de los ratones Control se disponían de forma homogénea a lo largo de la epidermis, asociados a una glándula sebácea discreta, formada por 4-6 células grasas (Figura 15H). Entre las
alteraciones más llamativas de la piel de los ratones K5-CYLDC/S envejecidos cabe destacar la hiperplasia papilomatosa, caracterizada por picos de epidermis gruesa y valles de epidermis muy adelgazada (en ocasiones se distinguía una sola capa de queratinocitos basales), lo que daba la apariencia de una piel delgada y arrugada (Figura 15J). Además, se observó que los queratinocitos de las regiones de atrofia epidérmica de los ratones transgénicos mostraban alteraciones morfológicas importantes, ya que frente a los queratinocitos basales de la epidermis de los ratones Control, de forma cúbica y polarizados, los queratinocitos basales de los ratones K5- CYLDC/S habían perdido su polaridad y mostraban una morfología aplanada y con núcleos paralelos a la capa basal (comparar los insertos de las figuras 15H, J). La falta de polaridad de la epidermis por ausencia de la actividad catalítica de CYLD la habíamos descrito previamente en los equivalentes de piel humanos HaCat- CYLDC/S202. Otra alteración que detectamos en los ratones transgénicos viejos fue el escaso tejido adiposo que había en la hipodermis, y que junto con la atrofia epidérmica contribuía a la apariencia de piel muy delgada característica de estos ratones. También se observaron cambios cualitativos en la dermis de los ratones transgénicos, que aparecía más densa y con fibras de colágeno más anchas, paralelas entre sí (Figura 15K). La piel de la cola de los ratones transgénicos presentaba alteraciones histológicas similares a las descritas en la piel del lomo (Figura 15D-G, L-O). Se detectaron igualmente signos de envejecimiento prematuro en otros epitelios estratificados de los ratones K5-CYLDC/S , por ejemplo, presentaban atrofia del epitelio que recubre la lengua (Figura 16A-B); y en menor medida, también atrofia del paladar (Figura 15C-D). En la piel de los párpados (Figura 16E-F) y del hocico (Figura 16G-H) se apreciaba frecuentemente la presencia de glándulas sebáceas hiperplásicas; en la piel plantar de los ratones transgénicos se detectaron áreas con atrofia de la epidermis e hipoplasia de las glándulas ecrinas (Figura 16I-J). En conjunto todas las alteraciones encontradas en estos órganos de los ratones transgénicos son propias del envejecimiento y no se manifestaban en los ratones Control de la misma edad, lo que indicaba que los ratones K5-CYLDC/S mostraban un envejecimiento prematuro.
Figura 13. Alteraciones macroscópicas en los ratones K5-CYLDC/S. Imagen representativa de la
cifosis presentada por los animales transgénicos K5-CYLDC/S y no observada en los controles de su misma edad.
Figura 14. Histología de la piel de lomo de ratones control y transgénicos de 1 y 3 meses de edad. (A) Imagen representativa de la piel del lomo de un animal Control de 1 mes de edad. Las flechas señalan
las glándulas sebáceas que acompañan a los FP; éstos están en anagén. (B-C) Piel de ratones K5- CYLDC/S de 1 mes de edad. (B,C) muestran la presencia de glándulas sebáceas hiperplásicas (flechas blancas) y de picos epidérmicos (flechas rojas). Los FP no han iniciado la fase de anagén del segundo ciclo del pelo. (D, E) Detalle de la piel de un ratón Control (D) y un transgénico (E) donde se aprecia el
ligero adelgazamiento de la epidermis de los ratones K5-CYLDC/S. (F) Imagen representativa de la piel de
lomo de un ratón Control de 3 meses de edad. (G-I) Agravamiento de las alteraciones cutáneas observadas en los ratones transgénicos de 1 mes. Flechas blancas: glándulas sebáceas; flechas rojas verticales: picos epidérmicos; flechas rojas horizontales: áreas de atrofia epidérmica. Barras de escala: 250 µm (C, F-I); 200 µm (A, B); 150 µm (D, E).
Figura 15. Análisis histopatológico de la piel de lomo y cola de ratones Control y transgénicos. (A- G) Adultos jóvenes (8 meses de edad); (H-O) Ratones viejos (20 meses de edad). A Imagen
representativa de la piel del lomo de un ratón Control. (B, C) Piel de lomo de ratones transgénicos. Las flechas negras señalan las regiones de hiperplasia papilomatosa. Las flechas blancas señalan glándulas sebáceas hiperplásicas; los asteriscos y los insertos a mayor aumento muestran áreas de atrofia epidérmica. (D) Imagen representativa de la piel de cola de un ratón Control de 8 meses de edad. (E-G) Piel de cola de ratones transgénicos. Fechas blancas: glándulas sebáceas hiperplásicas; flechas negras: zonas de hiperplasia. (H) Imagen representativa de la piel de lomo de un ratón Control de 20 meses de edad. (I-K) Piel de lomo de ratones transgénicos de 20 meses de edad en los que se observa que las alteraciones de la piel se hacen más acusadas a medida que los ratones envejecen: zonas más extensas de atrofia epidérmica (detalle a mayor aumento en I y J); Las flechas negras en J y K señalan zonas de hiperplasia papilomatosa y picos epidérmicos. Las flechas blancas muestran numerosas glándulas hiperplásicas, huérfanas y agrupadas en la dermis. (L) Imagen representativa de la piel de la cola de un ratón de 20 meses de edad. En el inserto se aprecia la piel interfolicular, formada por una capa basal y 12-18 capas suprabasales de queratinocitos diferenciados. (M-O) Piel de cola de ratones transgénicos en los que se aprecia la atrofia de la piel interfolicular formada por 2-3 capas de queratinocitos con defectos en maduración y diferenciación (ver inserto a mayor aumento en M, N). Las flechas blancas en (O)
Figura 16. Análisis histológico de la lengua, paladar, párpado, hocico y piel plantar de ratones Control y transgénicos de 20 medes de edad. (A, B) Epitelio estratificado de la lengua, donde se
observa la atrofia del epitelio de los ratones transgénicos (B), frente al de los ratones Control (A). (C, D) Atrofia del epitelio del paladar de los ratones transgénicos (D) frente al de los ratones Control (C). (E, F) Imagen representativa de la piel del párpado de ratones Control (E) y transgénicos (F). Nótese las glándulas sebáceas hiperplásicas y muy numerosas en los ratones transgénicos (englobadas en cículos) en claro contraste con las de ratones Control (flechas negras). (G, H) Histología en la que se observa la presencia de glándulas sebáceas hiperplasicas y muy abundantes en la piel de hocico de los ratones K5-
CYLDC/S (H) (englobadas en círculos), frente a las de los ratones Control, pequeñas y menos numerosas
(G). (I, J) Imagen representativa de la piel plantar de ratones Control (I) y transgénicos (J), en la que se
aprecia la presencia de escasas glándulas ecrinas en la planta de las patas de los ratones transgénicos. Barras de escala: 400 µm (A-D); 250 µm (I, J); 200 µm (E-H).
4. Aumento de la proliferación de las glándulas sebáceas y diferenciación