4.4.1. Licuefacción
Una vez obtenidas las harinas se sigue con la licuefacción. Para ello se utilizó una amilasa comercial, la cual se aplica sobre una preparación de la materia prima a determinadas condiciones de temperatura y pH.
4.4.1.1. Enzima
En la licuefacción se usó Termamyl ® 120L de Novozymes. Esta enzima es una α-
amilasa bacteriana termoresistente (E.C. 3.2.1.1) con 120 KNU/g de actividad enzimática. Donde KNU (Kilo Novo Unit) se define como la cantidad de enzima que puede hidrolizar 5.26 g (en base seca) de almidón soluble por hora a 37°C y a un pH de 5.6 (Bravo et al., 2006).
Esta α-amilasa termoresistente se obtiene a partir de una cepa de Bacillus
licheniformis modificada genéticamente, la cual es sometida a una fermentación
sumergida para posteriormente separar y purificar la enzima de este microorganismo (Novozymes, 2009). La función de esta endo-enzima en el sistema es hidrolizar de forma aleatoria los enlaces glucosídicos α-1, 4 del almidón
para formar dextrinas y oligosacáridos, así como glucosa y maltosa, aunque estos últimos azúcares en menores cantidades (VRP, 2005).
4.4.1.2. Proceso
La harina obtenida durante la molienda, fue pesada en una balanza analítica Ohaus Precision Plus TP 4000D (N.J, USA) y mezclada con agua bidestilada de forma que se obtuviera una mezcla con 30% de sólidos. Se agregó un 0.5% de CaOH en relación al total de materia seca. Los sólidos totales usados en cada uno de los tratamientos fueron 150 g.
Una vez adicionado el hidróxido de calcio, se ajustó el pH a 6.5, usando HCl 0.1N. De forma paralela se ajustó la temperatura de un baño de agua con agitación (Hot Shaker, BellCo, Glass, Inc. Vineland, NJ, USA) con agitación media a 95°C.
Una vez alcanzada la temperatura en este equipo, se introdujo la mezcla bajo agitación durante 15 minutos hasta alcanzar 57°C. Se agregaron 100 µL de Termamyl® 120 por cada 150 g de materia seca. Se dejó durante 15 minutos adicionales (hasta lograr 74°C) y se agregaron otros 100 µL de Termamyl® 120 por cada 150 g de materia seca. El material así tratado fue dejado en estas condiciones de temperatura durante los 195 minutos de licuefacción.
El muestreo se llevó a cabo cada 5 minutos durante los primeros 30 minutos. En los siguientes 50 minutos se tomaron muestras cada 10 min para después disminuir la frecuencia cada 15 minutos hasta completar los 195 minutos del proceso.
Las muestras se almacenaron de forma inmediata en tubos de polipropileno de 15mL a -20°C en un congelador (U2020 GA14 Model, Kendro Laboratory Products, Asheville, NC, USA) y se mantuvieron así hasta la caracterización del perfil de azúcares reductores. En la figura 4.4.1 se presenta un esquema del proceso de licuefacción y muestreo en esta etapa.
Figura 4.4.1 Etapa de licuefacción y toma de muestras. En A se muestra la licuefacción de tratamientos con maíz entero y maíz rolado al vapor, así como en B y en C. Las muestras se
almacenaron antes de su procesamiento en tubos de polipropileno de 15 mL con tapa en congelación a -20°C (D)
A B
4.4.2. Sacarificación
Posterior a la licuefacción tiene lugar la sacarificación. En esta etapa se sigue con la hidrólisis de las cadenas de almidón y dextrinas iniciada en la etapa de licuefacción. Para ello se utilizó una mezcla enzimática comercial, así como condiciones de temperatura y pH que favorecieran esta reacción.
4.4.2.1. Enzimas
Se utilizó una mezcla de amiloglucosidasa (E.C. 3.2.1.3) con pululanasa (E.C 3.2.1.41), denominada de forma comercial como Dextrozyme E ® de la empresa Novozymes. La amiloglucosidasa es una exoamilasa obtenida comercialmente de una cepa modificada de Aspergillus niger. La función de esta enzima es hidrolizar los enlaces α-1, 4 aún presentes en las dextrinas obtenidas en la etapa de licuefacción, sin embargo, también puede hidrolizar los enlaces α-1, 6 presentes en la parte ramificada de la molécula de almidón.
Esta acción desramificadora ocurre hasta 15 veces más lento que la hidrólisis de enlaces α 1, 4 (López-Munguía, 1998a). Por esta razón se usa en estas mezclas comerciales pululanasa, endoenzima que hidroliza enlaces α1, 6, obtenida a partir
de Bacillus deramificans (Słomińska et al., 2003). Con esta enzima se acelera por
Si el proceso se llevara a cabo con sólo la enzima amiloglucosidasa, agregando en exceso para intentar superar la baja tasa de reacción, se tendría el problema de una reacción reversible, lo cual reduciría los equivalentes de dextrosa del producto final. Entonces, tanto la baja tasa de reacción, como la reversibilidad del proceso son solucionadas con la adición de pululanasa.
4.4.2.2. Proceso
La mezcla obtenida durante la licuefacción se enfría hasta 60°C y posteriormente se ajusta el pH a 5.5 utilizando HCl 0.1N. Se midió el volumen y por cada 200 mL de suspensión se adicionó 1 mL de Dextrozyme ®. Se colocó este material en una incubadora con agitación (Innova 4000 New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) a 60°C a 160 RPM de agitación durante 14 horas.
Se tomaron 2 mL de muestra por duplicado en tubos de centrífuga de polipropileno. Estas muestras fueron tomadas cada 15 minutos durante las primeras seis horas de reacción, posteriormente se tomaron cada 30 minutos hasta completar las trece horas y la última muestra se tomó en la hora 14.
Las muestras fueron almacenadas de forma inmediata en congelación (-20°C, U2020 GA14 Model, Kendro Laboratory Products, Asheville, NC, USA) después de ser colocadas por 1 minuto en agua hirviendo para detener la reacción enzimática.
4.4.3. Fermentación
Esta es la etapa en la cual se obtiene etanol a partir del mosto obtenido en la licuefacción y posterior sacarificación.
4.4.3.1. Inóculo
Se utilizó levadura seca (Sacharomyces cerevisiae, Nevada®, Safmex, Toluca,
México), la cual fue suspendida en agua bidestilada estéril (1 g de levadura en 100 mL de agua) y mantenida a 30°C de 25 a 30 minutos para favorecer su hidratación y activación.
Se evaluó la viabilidad del inóculo inicialmente usando la prueba de azul de metileno, al disolver 0.01 gramos a 100 mililitros de agua destilada. Se colocaron cantidades iguales de colorante y muestra de inóculo previamente diluida, se esperaron 5 minutos y se colocaron en cámara de Neubauer. Se realizó conteo de células decoloradas en el microscopio con un objetivo 40x.
Esta determinación de viabilidad también se llevó a cabo al comparar el número de unidades formadoras de colonias obtenidas en una placa de agar YM (YM Broth DIFCO® Lote 821355 / Agar-Agar Merck, Lote VM820814 712) incubada a 30°C durante 36 horas, contra el número de células contabilizadas en el inóculo.
Para el conteo de levaduras se usó el método Yeast-4 (ASBC, 1992) con cámara de Neubauer (Marienfeld, Alemania).
Con este resultado se realizó el ajuste correspondiente a la cantidad de inóculo a utilizar durante la fermentación.
4.4.3.2. Acondicionamiento del mosto
Antes de la fermentación, el producto obtenido en la sacarificación fue enfriado a temperatura ambiente y posteriormente filtrado usando una malla de plástico de 1 mm de diámetro. Para minimizar las pérdidas de glucosa, los sólidos fueron enjuagados con 200 mL de agua bidestilada. Los mostos se clarificaron mediante centrifugación (RC5C Sorvall Instruments, Newtown, CT, USA) a 3500 rpm 15°C durante 15 minutos. Los sólidos separados fueron almacenados en congelación a -20°C. El sobrenadante se ajustó a 13°Plato y se enriqueció con 150 mg/L de alfa amino nitrógeno (extracto de levadura Yeastex 1433 Probamex, Naucalpan, México).
El mosto así acondicionado fue pasteurizado a 70°C durante 30 minutos, para posteriormente ser enfriado en un baño de agua con hielo a 35°C antes de la inoculación.
4.4.3.3. Proceso de fermentación
La fermentación se llevó a cabo con lotes de 125 mL de mosto. Se usaron como reactores matraces Erlenmeyer de 250 mL sellados con un tapón de caucho. Para el muestreo se colocaron en el tapón tubos de vidrio y una jeringa tal como se muestra en la figura 4.4.2.
Figura 4.4.2 Sistema de fermentación y muestreo.
Todo el material utilizado en el proceso de fermentación se esterilizó. El armado del sistema de fermentación y muestreo se llevó a cabo en una campana de flujo laminar (Model 36212 Type A2, Labconco, Kansas, USA), en donde se colocó también el mosto ya pasteurizado y enfriado.
Se agregó el inóculo para alcanzar una concentración inicial en el mosto de 1.6x107 células/mL (1.3x107 más un porcentaje adicional para compensar las células no viables presentes en la levadura usada como inóculo).
Los matraces ya sellados e incubados fueron colocados en una incubadora con agitación (Lab-Line Modelo 3526) a 30°C y 125 RPM durante 72 horas.
Se tomaron muestras del mosto a lo largo del proceso para caracterizar el consumo de sustrato y la formación de productos durante la fermentación. Estas muestras se tomaron al tiempo cero así como a las 5, 10 20, 30, 50 y 72 horas de fermentación.
Las muestras se colocaron en tubos de 15 mL con tapa (polipropileno) y se almacenaron inmediatamente en congelación a -20°C (U2020 GA14 Model, Kendro Laboratory Products, Asheville, NC, USA).