Chip formation and morphology

En las últimas décadas el interés en el estudio de la epidemiología local y global de C. albicans ha aumentado debido a que se conocen aspectos más profundos de sus mecanismos de virulencia, su facilidad de transmisión y su aumento en la resistencia a antifúngicos. Por esta razón, MLST resulta ser una herramienta útil en la identificación de aislamientos que parecen ser idénticos (clones) o estar estrechamente relacionados (líneas clonales), lo cual permite la discriminación entre infecciones recurrentes y reinfecciones. Así mismo, puede ser utilizada de la mano con otras técnicas de tipificación como la tipificación ABC (Lott, Holloway et al. 1999; Odds, Davidson et al. 2006; Da Matta, Melo et al. 2010), el estudio de cariotipos (Cowen, Sanglard et al. 2000; Diogo, Bouchier et al. 2009), la tipificación “Mating Type Locus” (Butler, Rasmussen et al. 2009) o los microsatélites (Chavez-Galarza, Pais et al. 2010), para caracterizar cepas y establecer relaciones filogenéticas entre diferentes poblaciones.

69 En patologías como la candidiasis vulvovaginal la aplicación de MLST, ha permitido conocer y entender las causas de que algunas mujeres desarrollen CVVR. Teorías que sugieren que el tracto gastrointestinal es el reservorio de las cepas de C. albicans que causarán futuras infecciones (Miles, Olsen et al. 1977) o que la transmisión sexual es una de las causas de CVVR (O'Connor and Sobel 1986), no podrían ser confirmadas o descartadas sin el desarrollo de metodologías como MLST, las cuales pueden ser utilizadas para resolver este tipo de interrogantes, no solo para aclarar el origen de enfermedades como la CVVR, sino para direccionar su tratamiento.

La exploración de la metodología MLST en Colombia, puede ser un gran paso en la evaluación y el conocimiento de diferentes patógenos, ya que es una técnica que abarca varias especies de bacterias y hongos. Adicionalmente, puede ser utilizada en diferentes áreas de la salud y contribuye a la toma de decisiones en cuanto el control y la prevención de patologías; no solo las causadas por C. albicans. Varios estudios alrededor del mundo han demostrado la efectividad de esta técnica, por medio de la identificación de orígenes y rutas de transmisión, como por ejemplo Bougnoux en 2002, quien encontró aislamientos relacionados en una Unidad de Cuidados Intensivos, sugiriendo que estos descendían recientemente de un ancestro común y que la microvariación era un evento ocurrido dentro del hospital estudiado, catalogando este evento como un brote y diferenciándolo de infecciones independientes, lo cual permitió las acciones de control correspondientes. En este mismo estudio, se estableció la transmisión vertical de una madre a su hijo por el canal del parto, al encontrar que tres aislamientos obtenidos de ambos pacientes, compartían DST’s idénticos (Bougnoux, Morand et al. 2002). Claramente, estos y muchos hallazgos más, evidencian la necesidad de implementar esta metodología en rutinas hospitalarias o en laboratorios de diagnóstico molecular en nuestro país, permitiéndonos dar un manejo adecuado a las diferentes situaciones que se presentan alrededor de las patologías causadas por C. albicans, de manera rápida y eficiente.

70 7.3.2 Exploración de tres herramientas de agrupamiento para el análisis de datos obtenidos por MLST.

En el proceso de exploración que realizamos de las tres herramientas (eBURST, goeBURST y UPGMA), encontramos diferentes opiniones a cerca de cada una. Con respecto a eBURST, se afirma que aunque la teoría en la cual se basa describe el genotipo ancestral de un complejo clonal como el ancestro común más probable a partir del cual los demás genotipos ligados descienden, recientes investigaciones han demostrado, que mientras esta premisa parece adaptarse bien a la mayoría de organismos para los cuales el número de “singletons” es mínimo, para las especies de Candida que son diploides la cantidad de “singletons” es muy alta, y que por otro lado, las tasas de recombinación no permiten que eBURST sea confiable al indicar el ancestro común (Odds and Jacobsen 2008). En nuestro estudio encontramos que la mayoría de resultados son similares entre eBURST y el recientemente implementado, goeBURST, sin embargo, la diferencias más importante se evidencia en la construcción de las gráficas, ya que eBURST solo tiene en cuenta la relación de los ST´s con el genotipo ancestral a partir del cual se diversifican y no las relaciones entre todos los ST´s, lo cual limita la interpretación de los resultados.

Por otro lado, Odds quien en 2008 realizó el análisis de los 1564 aislamientos reportados para esa época en la base de datos MLST, afirma que eBURST al ser aplicado a una población pequeña de varios aislamientos de C. albicans falla en encontrar y establecer relaciones con un ancestro común y que por esta razón esta es una herramienta útil pero que no contribuye en el análisis filogenético por sí misma (Odds and Jacobsen 2008). Esta afirmación concuerda con los resultados obtenidos, ya que esta herramienta debe usarse de la mano con otras herramientas bioinformáticas, en este caso UPGMA, que a diferencia del análisis por eBURST/goeBURST, no tiene en cuenta los fragmentos de los genes por separado en los cuales la secuencia tiene sitios polimórficos, si no que compara a partir de una sola secuencia concatenada, por lo tanto da una perspectiva diferente de las relaciones entre los aislamientos: aislamientos con pocas diferencias en las secuencias concatenadas son agrupadas como similares por UPGMA, aún si los sitios polimórficos están en diferentes fragmentos.

71 Teniendo en cuenta el parámetro utilizado para asignar los complejos clonales (compartir al menos 4 loci de 7), los resultados mostraron que la mayoría de los aislamientos fueron asignados a complejos clonales, en donde la elección de este parámetro permitió que solo un bajo porcentaje de aislamientos, permanecieran como “singletons”. Algunos estudios realizados por Odds y colaboradores en 2007 y 2008, así como por otros autores (Tavanti, Davidson et al. 2005; Takakura, Ichiyama et al. 2008), coinciden en el uso de eBURST/goeBURST y UPGMA como el grupo de herramientas que facilitan y mejoran la asignación de aislamientos a los diferentes complejos clonales y clados (respectivamente) Sin embargo, se debe tener presente que la prevalencia de “singletons” en las especies de Candida que son diploides (C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis y C. parapsilosis) es mucho más alta. Debemos resaltar que en todos los conjuntos explorados, los aislamientos dentro de los complejos clonales coincidieron con los asignados en los clados, al utilizar las tres herramientas.

A partir de esta exploración podemos concluir que goeBURST si constituye una herramienta mejorada con respecto a la versión anterior (eBURST), lo cual se evidencia para el usuario en gráficas más claras y completas de las relaciones entre ST’s, genotipos ancestrales y complejos clonales. Adicionalmente, goeBURST permite la división de los datos en varios complejos clonales de cepas relacionadas, en donde las reglas identifican qué unión entre los ST’s corresponde al patrón de descendencia más probable, sin tener sólo en cuenta la frecuencia de los aislamientos para asignar genotipos ancestrales como lo hace eBURST, optimizando globalmente las relaciones entre los aislamientos (Francisco, Bugalho et al. 2009). Así, esta supuesta diversificación del genotipo ancestral se refleja en la aparición de ST’s que difieren en solo uno de los genes (SLV), en dos (DLV) o en tres (DLV).

Como se comentó anteriormente, el resultado de eBURST es un grupo de complejos clonales sin relación entre ellos que no vincula a toda la población estudiada, por esta razón los resultados fueron mostrados como tablas para eBURST y como gráficas para goeBURST, ya que con respecto a los datos y a la asignación de genotipos ancestrales los resultados entre las dos herramientas fueron similares, sin embargo goeBURST refleja los

72 datos de forma mucho más clara y brindando más información en la construcción de sus gráficas.

Dentro de este estudio, fueron evaluados cuatro conjuntos de datos con diferentes características, en los cuales se analizaron y se establecieron relaciones entre 15, 36, 114 y 238 aislamientos de C. albicans. Este tipo de análisis con los conjuntos de datos que utilizamos (datos reportados por Colombia, por países de Latinoamérica, así como de reportes de origen vaginal), no se han llevado a cabo hasta la fecha, por tal razón los datos obtenidos contribuyen con el conocimiento de las poblaciones de C. albicans tanto a nivel local, como a nivel global. Adicionalmente, al reportar e incluir los 15 aislamientos de C. albicans involucrados en procesos de candidiasis vulvovaginal, se aportan y se comparten datos para que la base de datos global siga creciendo.

73 8. CONCLUSIONES

• Se asignaron perfiles alélicos únicos (DST) a los 15 aislamientos involucrados en procesos de candidiasis vulvovaginal, indicando que esta población no es clonal y sugiriendo posibles eventos de recombinación y microvariación en los fragmentos de los siete genes estudiados.

• Debido a que los resultados muestran que los 15 aislamientos involucrados en procesos de candidiasis vulvovaginal, no son clonales, no se hace necesario el uso de otras técnicas de tipificación, ya que MLST fue capaz de reconocer todos los aislamientos como diferentes, aún siendo de la misma especie.

• De 15 aislamientos obtenidos de mujeres de diferentes municipios de Cundinamarca, 10 aislamientos se relacionan estrechamente entre sí, constituyendo tres complejos clonales independientes que se mantienen, lo cual es explicado por la similitud de sus secuencias en cuatro o cinco y de los siete genes evaluados. Los 5 aislamientos restantes no se relacionan con los demás por lo que son catalogados como “singletons”.

• En el estudio de las relaciones filogenéticas con aislamientos reportados por otros grupos de investigación colombianos o latinoamericanos, no se evidencia una relación cercana, ya que aunque se asocian en los mismos clados, se agrupan en complejos clonales diferentes.

• Seis de los aislamientos reportados en este estudio se relacionan con aproximadamente el 40% de los aislamientos vaginales reportados en la base de datos MLST C. albicans consenso por diferentes países del mundo, los cuales se agrupan en el complejo clonal 1/clado 1.

• Teniendo en cuenta los resultados del análisis de las relaciones filogenéticas, arrojados por las tres herramientas (eBURST, goeBURST y UPGMA), se puede afirmar que existe correlación entre los complejos clonales obtenidos por eBURST/goeBURST y los clados obtenidos por UPGMA en todos los conjuntos de datos evaluados.

74 • Para el análisis de las relaciones entre aislamientos de C. albicans con datos obtenidos por la técnica MLST, se recomienda utilizar goeBURST ya que constituye una herramienta mejorada que muestra gráficas más claras y completas de las relaciones entre ST’s, genotipos ancestrales y complejos clonales. Adicionalmente, esta debe complementarse con herramientas como UPGMA ya que permiten un panorama más amplio de las relaciones filogenéticas.

• Las secuencias obtenidas por medio de MLST, al ser incluidas dentro de la base de datos global, aporta al estudio de la epidemiología y a la investigación del origen y las rutas de transmisión de C. albicans. Así mismo, con el ingreso de esta información en la base de datos MLST C. albicans consenso, se contribuye al aumento de reportes por Colombia y Latinoamérica.

75 9. RECOMENDACIONES

• Evaluar por MLST la dinámica poblacional de C. albicans en pacientes con CVVR en donde se pueda establecer el mantenimiento o el remplazo de cepas involucradas en este proceso, ya que esta es una de las enfermedades fúngicas con mayor morbilidad que afecta a mujeres de todo el mundo.

• A partir de la exploración de MLST se sugiere implementar este tipo de técnicas en laboratorios de investigación y diagnóstico molecular en Colombia, no solo para el estudio epidemiológico de C. albicans, si no para cualquiera de los microorganismos que poseen esquemas y bases de datos MLST.

• Implementar un protocolo unificado para la extracción y amplificación de ADN, que facilite el desarrollo de la técnica MLST en el laboratorio.

• Profundizar en el conocimiento de metodologías tanto experimentales como computacionales, ya que esto permite contar con un panorama más amplio para generar posibles soluciones a problemas en salud.

76 10. BIBLIOGRAFIA

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