Conclusions

Después de la fragmentación, la selección de fragmentos de ADN en el rango de 100 a 400 pb mediante la utilización de una solución de Agencort AMPure XP beads (Beckman coulter).

Esta solución debe ser homogénea y atemperada.

Cada muestra se dispensa en una placa nueva, se le añaden 180 μl de Agencort AMPure XP beads. Se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se deposita la placa encima de un soporte magnético y se retira el sobrenadante. Se añaden 300 ml de etanol al 70% (Este proceso se repite dos veces). Se retira nuevamente el etanol y se dejaron secar Agencort AMPure XP beads a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se les añade 50 μl de agua libre de DNAsas.

Se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para que el ADN se deposite en la solución. Se coloca la placa en el soporte magnético y se conserva el sobrenadante.

Se confirma el tamaño de los fragmentos mediante electroforesis automática utilizando para ello la Tapestation 2200 de Agilent Technologies siguiendo el protocolo del fabricante.

Para realizar la electroforesis de alta resolución se procedió de la siguiente manera:

Para cada muestra, se añade 3 μl del reactivo D1000 Sample Buffer y 1 μl de muestra. La placa se agita durante 1 minuto a 2000 rpm en agitador IKA MS3 Vortex y se centrifuga. Una vez finalizado, se carga en la máquina y se cuantifican los picos comprendidos entre 200-250 pb como se muestra en la Figura 16.

69 Figura 16. Tamaños de los fragmentos después de la rotura del ADN con el Covaris

Preparación de la muestra para la secuenciación

Dado que la fragmentación del ADN en el Covaris da lugar a extremos cohesivos, es necesaria su su conversión a extremos romos como se muestra en las figura 18 .

Para ello, las muestras son incubadas con exonucleasa Klenow (3´-5´), T4 ADN polimerasa y la T4 Quinasa en presencia de dNTPs. La T4 ADN polimerasa elimina los extremos 3´ protuberantes (actividad polimerasa) y junto con la exonucleasa Klenow rellena los fragmentos en la posición 5´. La fosforilación final del extremo 5´ ocurre en paralelo por la acción de la T4 Quinasa. Este proceso tiene lugar durante 30 minutos a 20ºC.

Una vez finalizado se procede a la purificación con Agencourt AMPure XP beads, siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Inmediatamente después es necesario realizar la adenilación del extremo 3´ con la ayuda de la Exo Klenow polimerasa; esta reacción se lleva a cabo a 37ºC durante 30 minutos.

Figura 18. Representación esquemática de la molecula de AND una vez se le han rellenado los extremos para acabar con extremos romos

70 Figura 19. Esquema de la molécula de ADN una vez que tiene los extremos adenilados

De nuevo se repite el proceso de purificación con Agencourt AMPure XP beads.

A continuación, se procede a la ligación de los adaptadores específicos mediante la T4 DNA ligasa por un tiempo de 15 minutos a 20ºC. El adaptador empieza con una T que es complementaria de la A insertada en el paso anterior (ver figura 20) , la estructura final se puede ver en la Figura 20.

Figura 20. Esquema de la molécula final con los adaptadores, la primera base de los adaptadores es una T

Se vuelve a purificar con Agencourt AMPure XP beads.

Seguidamente se procede a la amplificación de los fragmentos de ADN mediante PCR utilizando los cebadores: InPe1.0 y Precapture PCR junto con la Herculasa II Fusion DNA Polimerasa durante 4 ciclos. Esta reacción se realiza por duplicado.

Se mezclan ambos productos de amplificación y nuevamente se realiza la purificación mediante Agencourt AMPure XP beads. Para la confirmación de que los adaptadores se ligan adecuadamente a los fragmentos de ADN se realiza una mediada de control mediante una electroforesis en la Tapestation 2200, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. El resultado debe arrojar un rango de picos comprendido entre 300-320 pb, con una concentración de alrededor de 40 ng/μl. Como se muestra en la Figura 21

Para la hibridación, la concentración de ADN de las muestras es ajustada a 147 ng/μl. Para ello se utiliza una centrífuga de vacío (Eppendorf Vacufuge Plus concentrator). Y se resuspenden en el volumen necesario para obtener 500 ng en un volumen de 3,4 μl.

71 Figura 21. Medida del tamaño del producto obtenido después de la PCR por duplicado

La hibridación se realiza siguiendo el protocolo SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library versión 1.2 de Mayo del 2011 de Agilent Technologies.

Se preparan los reactivos en las proporciones indicadas en el protocolo, incluyendo un tampón de hibridación, una master mix con diferentes agentes bloqueantes y las sondas de captura.

Se necesitan 3 termocicladores, dos de ellos con temperaturas a 65ºC, por un lado el termociclador A que tiene la Placa A en la que se le añadió entre 15-18 μl de buffer de hibridación a cada pocillo.

El termociclador B con la Placa B que contiene la Master mix con los oligonucleótidos que van a impedir que durante el proceso de hibridación se formen dímeros de moléculas de ADN. El ciclo del termociclador es de 95ºC durante 5 minutos, el ADN sufre una desnaturalización, y 65ºC durante al menos otros 5 minutos, tiempo en el que se hibrida los oligonucleótidos bloqueantes con la librería generada formada por ADN de cadena simple (figura23)

Figura 22 Esquema que muestra la función de los oligonucleótidos bloqueantes para que las moléculas no hibriden entre sus extremos

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Transcurridos esos cinco minutos se traspasan 13μl de la placa A, a la placa C y 9 μl de la placa B a la C. A la placa C se le añaden 7 μl de la Master MIx de las sondas de captura, que contienen 2 μl de las sondas de captura y 5 μl de RNasa block. figura24

Figura 23. Esquema de trabajo para la Hibridación

Se procedió al sellado de la placa C.

Transcurridas las 24 horas que dura la hibridación a 65ºC, se procede a la captura.

Las regiones de interés son capturadas mediante la utilización de Dynal MyOne Streptovidin T1 (Invitrogen) y, posteriormente, son purificadas con Agencourt AMPure XP beads. Una vez purificadas se procede al indexado de las librerías donde a cada muestra se le inserta una etiqueta o índice diferente de 6-8 nucleótidos conocidos. Para ello se realiza una PCR de 12 ciclos. Posteriormente se purifica con Agencourt AMPure XP beads y se confirma que el rango de los fragmentos de ADN este comprendido entre 330-350 nucleótidos mediante electroforesis automática utilizando el chip de alta sensibilidad

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Posteriormente se realiza una cuantificación por duplicado de cada muestra utilizando fluorescencia en el Qubit con el kit High Sensitivity, y se calcula la molaridad de cada muestra siguiendo la siguiente fórmula:

Una vez que se ha calculado la molaridad de cada muestra se realiza un pool siguiendo la siguiente fórmula:

El resultado obtenido es en nanomolar.

Una vez constituido el pool se procedió a medir su molaridad mediante el uso de la Tapestation de Agilent con el kit High Sensitivity por triplicado. El resultado debe ser similar al calculado en el paso anterior. Se calculó la molaridad como la media de las 3 medidas, y además para comprobar que la tapestation no ha cometido ningún error se utiliza una muestra a una molaridad de 10nM como control (figura25).

74 Figura 24. Resultado de la Tapestation 2200 para la medición de los pooles de secuenciación