Controlling Endpoints1-3 IN

Esta investigación empleó un panel de asociación genética que fue caracterizado para el rasgo de tolerancia a estrés por déficit hídrico, para lo cual se evaluaron variables fisiológicas y bioquímicas y se estimaron índices de crecimiento.

2.4.1 Material vegetal y sitio de la investigación

Se empleó un panel de asociación genética que fue la Colección de Trabajo de Papa del Programa de Fitomejoramiento de la Universidad Nacional de Colombia. Esta colección está constituida por 109 accesiones de papa diploide (Solanum tuberosum, Grupo Phureja), propagada vegetativamente a partir de tubérculos.

El experimento se llevó a cabo en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, ubicada a 2.540 msnm (4°35'56 "N, 74°04'51" O). El ensayo se estableció bajo invernadero de plástico, entre el 22 de junio a 2 de noviembre de 2018, correspondiente a un ciclo de cultivo (siembra-cosecha) de 120 días. Las condiciones ambientales durante el experimento fueron: temperatura 17-24 °C y humedad relativa 55%-77%. Estas variables se registraron con un datalogger modelo DT-171 (CEM Instruments) cada 12 horas y fueron tomadas a las 10:03 y 22:03 horas.

2.4.2 Establecimiento del experimento

Para evaluar el efecto del estrés por déficit hídrico, se establecieron dos tratamientos así, (i) Un tratamiento control (C), en el cual las plantas se regaron durante todo el ciclo de cultivo cada 2 días, llevándolas a capacidad de campo (100%), para un total de 20.350 cm3

de aguapor planta. (ii) El tratamiento de déficit hídrico (E), en el cual se suspendió el riego completamente a los 60 días después de siembra (DDS) durante 15 días. Esta suspensión de riego se aplicó aproximadamente en el momento en que inicia la tuberización para los diversos genotipos. Se seleccionó este punto, como el momento para la suspensión del riego, ya que se considera una etapa crítica para estrés hídrico de acuerdo con Lynch y Tai (1989). El contenido de agua fue monitoreado por un sensor WET-2 Sensor/HH2 Moisture Meter (Delta-T- devices, Cambrigde, UK).

El ensayo se estableció en un diseño de parcelas divididas en donde las parcelas principales correspondieron a 3 repeticiones (siembras escalonadas) y las subparcelas

Caracterización fenotípica de papas diploides colombianas frente a estrés por déficit hídrico

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correspondieron a las plantas en condición con riego y sin riego, con 4 plantas para cada condición de riego, C y E.

El ensayo se sembró de manera escalonada en 3 repeticiones, distribuidas así; la repetición 1 inició el 22 de junio, la repetición 2 inició el 26 de junio y la repetición 3 inició el 3 de julio de 2018. En cada una se sembraron los 109 genotipos de la colección CCC, y por cada genotipo se sembraron 8 tubérculos, 4 plantas por cada tratamiento (con estrés y sin estrés).

Los tubérculos se sembraron en bolsas plásticas negras de 5 L de capacidad. El sustrato empleado fue una mezcla de suelo y arena de río en relación 3:1. Se empleó un tubérculo por bolsa y se fertilizó en corona al momento de la siembra. Se aplicó 40 g de un fertilizante compuesto en grado 10-30-10 y Agrimins® en proporción 3:1. El aporque se realizó de forma individual, 30 DDS y se empleó 1 kg del sustrato, igual al empleado en el momento de la siembra.

A los 40 DDS las plantas se tutoraron, con el fin de facilitar la manipulación del material durante las mediciones. El material vegetal se cosechó cuando se alcanzó la madurez fisiológica de tubérculo, aproximadamente a los 120 DDS, considerado como la duración del ciclo de cultivo en condiciones de temperatura promedio de 14,2-17,06 °C y humedad relativa de 86,7% (Rodríguez et al., 2009).

2.4.3 Componentes de rendimiento y variables de

crecimiento evaluadas

Al momento de la cosecha, aproximadamente 120 DDS, las plantas fueron removidas de las bolsas plásticas y a partir de allí se realizaron las mediciones directas. Se midieron los componentes de rendimiento de acuerdo con Lynch y Kozub (1990) para lo cual se realizó el conteo del número de tubérculos (NT) y se consideraron los que presentaron un diámetro igual o mayor a 1 cm de diámetro. Luego los tubérculos se pesaron todos en conjunto y con ello se estimó el rendimiento total por planta (R). A partir del cociente entre el R y el NT, se obtuvo el peso promedio de tubérculos (PPT).

Las plantas cosechadas fueron almacenadas en bolsas de papel, separadas por órganos, así; parte aérea (hojas y tallos) y la parte subterránea (raíz y tubérculos). Todo el material

38 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

vegetal se secó a 70 °C hasta alcanzar peso constante (aproximadamente 72 horas después de iniciar el secado) en un horno marca WTB binder type 78532 Tuttlingen. Posteriormente, se pesó cada uno de los órganos y se obtuvo el peso seco de la parte aérea, de raíz y de tubérculos, la sumatoria de los pesos secos correspondió al peso seco total (PST). Empleando la información de los órganos por separado se estimaron variables alométricas de crecimiento descritas en la Tabla 1-1, de acuerdo con Di Benedetto & Tognetti, (2016) y Gardner et al. (1985).

Tabla 2- 1- Variables alométricas de crecimiento evaluadas, a cosecha y después de secado a 70ºC en germoplasma de papa diploide. Se presenta el nombre de la variable y la ecuación para su estimación.

Nombre Ecuación

Índice de cosecha (IC) _{𝐼𝐶 =} 𝑃𝑆𝑇𝑏

𝑃𝑆𝐴 + 𝑃𝑆𝑇𝑏∗ 100 Porcentaje de raíz (p.ra) 𝑝. 𝑟𝑎 = 𝑃𝑆𝑅

𝑃𝑆𝑇 ∗ 100 Porcentaje de parte aérea (p.pa) _{𝑝. 𝑝𝑎 =} 𝑃𝑆𝐴

𝑃𝑆𝑇 ∗ 100 Relación raíz parte área (R.pa) 𝑅. 𝑝𝑎 = 𝑃𝑆𝑅

𝑃𝑆𝐴 ∗ 100

Peso seco parte aérea (PSA); Peso seco raíz (PSR) y Peso seco tubérculos (PSTb); Peso seco total (PST).

2.4.4 Variables evaluadas indicadoras de estrés

Se midió la variable de conductancia estomática (CE) ya que el cierre estomático es la primera respuesta de la planta ante el déficit de agua. Para esto se realizó la medición de la magnitud de intercambio de gases a partir de la conductancia estomática (CE). La cual se midió con un porómetro portátil (SC-1 Leaf Porometer. Decagon Devices Inc, Pullman- Gales). La CE se midió en 2 hojas completamente expandidas del tercio medio ya que son hojas totalmente desarrolladas. Se tomaron 3 mediciones en cada una de ellas. Los datos fueron tomados en el periodo comprendido entre las 8:00 y las 11:00 ya que hacía estás horas se presenta el cierre estomático (Rodríguez et al., 2017).

El contenido relativo de agua (CRA) se emplea como medida del estatus hídrico de la planta y se ha empleado para medir su afectación ante condiciones de déficit de agua

Caracterización fenotípica de papas diploides colombianas frente a estrés por déficit hídrico

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(Ariza et al., 2020). El CRA fue calculado según la ecuación descrita en la tabla 1-2 según la metodología de Liu et al. (2005). Se tomaron 3 hojas por tratamiento a los 120 DDS. Con una balanza de precisión (XB220A, Precisa, Swiss) se tomó el peso fresco de la hoja (PF). Luego, se dejó en placas de Petri con agua destilada a 20 °C durante 24 horas y se registró su peso (PSat). Posteriormente, se llevó a un horno marca WTB binder type 78532 Tuttlingen a 75°C durante 48 horas y se tomó de nuevo su peso (PS).

Tabla 2- 2. Variables fisiológicas medidas en germoplasma de papa diploide. Se presenta el nombre de la variable y la ecuación para su estimación.

Nombre Ecuación

Contenido relativo

de agua (CRA) CRA = (PF-PS)/(PSat-PS) x 100 Malondialdehido (MDA) 𝑀𝐷𝐴𝑒𝑞( 𝑛𝑀𝑜𝑙 𝑚𝑙 ) = [ (𝐴𝑏𝑠 532 + 𝑇𝐵𝐴) − (𝐴𝑏𝑠 532 + 𝑇𝐵𝐴) 155 ] ∗ 1000000

Peso fresco de la hoja (PF); Peso turgente (PSat); Peso seco total (PS); TBA: Ácido tiobarbitúrico, Abs: Absorbancia.

El daño de las membranas por efecto del estrés hídrico se cuantificó por medio del contenido de malondialdehído (MDA) el que se tomó como indicador de estrés. Se colectaron 5 hojas jóvenes del tercio apical de las 4 plantas de cada tratamiento y con ellas se preparó una muestra compuesta. Las hojas se maceraron en nitrógeno líquido y fueron almacenadas a -80 °C hasta su procesamiento.

La cuantificación del MDA se realizó de acuerdo con la metodología descrita por Heath y Packer (1968). Para esto se tomó 300 mg de material vegetal homogenizado, el que se dispuso en tubos falcon de 15 mL. Se agregó 4 mL de ácido tiobarbitúrico al 1% p/v. Los tubos se centrifugaron durante 10 min a 300 rpm. Se extrajo 1 mL del sobrenadante y se agregaron 4 mL de una mezcla de ácido tricloracético al 20% y ácido tiobarbitúrico al 0,65%

p/v, al mismo tubo. Los tubos se llevaron a un baño de agua durante 25 min a 95 °C.

Finalmente, las muestras se leyeron a 532 y 600 nm en un espectrofotómetro (spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA). Se calculó la concentración en equivalentes de MDA (Tabla 1-2).

40 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

2.4.5 Análisis estadístico

La respuesta al estrés para cada variable se determinó a partir de la diferencia entre el promedio de los tratamientos C y E, que permitió describir el efecto del estrés a partir de la magnitud de cambio (M). A partir del efecto estimado para todas las variables evaluadas se realizó un análisis de correlaciones de Spearman para determinar las variables con mayor relación, que se emplearon en un análisis de componentes principales (ACP) y agrupamiento por K-means (Legendre & Legendre, 1998) de las variables estandarizadas, empleando la librería “factoextra” (Kassambara, 2020). La estandarización se realizó para darle un mismo valor relativo a las variables, de manera que ninguna tuviera mayor peso. Para esto, se tomaron las variables restándoles su media y dividiéndolas entre sus desviaciones estándar.

Finalmente, se realizaron comparaciones entre grupos para cada variable, empleando un análisis de varianza (ANOVA) tipo 3 y comparaciones múltiples empleando la prueba de Tukey(p≤0.05) y la librería “Agricolae” (De Mendiburu, 2017). El análisis estadístico, se realizó con el software R (R Core team, Ver. 1.2.1235, 2020).