El proyecto se llevó acabo en condiciones de laboratorio acordes a las directrices de examen de desempeño OPPTS 810.3700 para repelentes de insectos que han de aplicarse a la piel humana por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA,2010). Y para evaluar la eficacia del extracto oleoso en base oleosa se realizó el siguiente procedimiento:
6.1) Obtención de hembras adultas de mosquitos Aedes aegypti:
La crianza se llevó acabo introduciendo huevos de la cepa Rockefeller en dos recipientes de polietileno con el fin de obtener una mayor producción de larvas de mosquitos, con agua libre de cloro, reposada por más de 72 horas, la alimentación en este estadio fue a base de comida de peces, de manera que se obtuvo una cantidad aproximada de 1000 larvas que tras su eclosión permitiera obtener un número considerable de mosquitos adultos que posteriormente se realizaría la separación por sexos, descartando los machos con el fin de sólo contar con las hembras para la realización de los bioensayos (Fuente Autoras)
6.2) Obtención del extracto:
Para el presente trabajo se utilizó material vegetativo fresco (hojas y tallos) de Cymbopogon citratus (Citronella) adquirido en la plaza de mercado del municipio de Soacha (Cundinamarca),
proveniente de cultivos comerciales oriundos del municipio de Silvania, puesto que el lugar de donde se extrajo realiza buenas prácticas de cultivo. Para eliminar el contenido de agua que naturalmente posee la planta, se sometió a secado a la sombra durante una semana en el
laboratorio de Zoonosis de la Facultad del Medio Ambiente de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas con temperatura ambiente promedio de 21°C y humedad relativa controlada de 30%. La extracción se llevó a cabo por el método caliente, proceso que consistió en obtener el material seco y posteriormente fraccionarlo en partículas de menor tamaño seleccionando 500 gramos de este material, el cual se dispuso en cartuchos de papel filtro en el extractor soxhelt usando como solvente etanol al 96% con el fin de separar el aceite que posee naturalmente la planta. La solución obtenida fue sometida a destilación a presión reducida utilizando un equipo roto evaporador Marca IKA RV10 a 100 rpm., con una presión de 150 mBar a 40°C con un flujo de agua de 41.5 litros por hora con el fin de separar el etanol y así obtener el aceite esencial (EPA, 1996).
El almacenamiento del aceite se dispuso en un frasco de vidrio color ámbar y se llevó a refrigeración a una temperatura de 4 °C conservándose para su posterior utilización en los bioensayos.
6.3) Selección de voluntarios para bioensayos:
Para la realización del experimento se requirió de 10 voluntarios teniendo en cuenta la cantidad de mosquitos hembra que finalmente se obtuvieron para el experimento: 5 mujeres y 5 hombres , los cuales fueron seleccionados al azar procedimiento recomendado en las directrices por la EPA; se les explicó en qué consistiría el experimento y los riesgos a los cuales podrían estar expuestos, posteriormente se les pidió firmar un consentimiento donde se avaló que su participación era
voluntaria y que estaban de acuerdo con la socialización de los resultados obtenidos (ver anexo 5) (EPA, 2010).
6.4) Bioensayos:
Los bioensayos se realizaron de igual forma bajo las directrices para la eficacia ensayo de repelentes de mosquitos para la piel humana de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2009). Se separaron las hembras descartando los machos, en jaulas entomológicas de malla mosquitera, lo que permitió realizar observaciones para verificar el efecto repelente. Se trabajó con 50 hembras para cada voluntario experimental, mantenidos en cámara de cría a las mismas condiciones de temperatura entre 28° C y 33° C que es la temperatura ambiente de la especie Aedes aegypti simulada en laboratorio, humedad ambiental mayor al 70%, fotoperiodo de 12 horas diurnas y 12 nocturnas y como única fuente de alimentos se colocaron motas de algodón impregnadas con agua azucarada.
Siguiendo las directrices de la OMS se calculó el área de aplicación (ver anexo 6) del repelente con la siguiente ecuación:
Área = ½ (CW + CE) ∗ DWE
Donde
CW: es la circunferencia de la muñeca en cm
CE: es la circunferencia del codo a la altura de la fosa cubital en cm DWE: es la distancia en cm entre el CE y CW. (OMS, 2009)
Se proporcionó a cada voluntario un guante de látex que cubrió únicamente la mano ya que esta no comprende el área de aplicación contemplada anteriormente.
6.5) Determinación de la concentración efectiva y tiempo de repelencia: Para llevar a cabo el análisis de la concentración efectiva se realizó una solución de aceite vegetal con el extracto de Citronella partiendo de una concentración al 10% y posterior
evaluación de concentraciones ascendentes hasta encontrar aquella que garantizara el 100% de repelencia. La dilución experimental en vehículo oleoso se aplicó uniformemente en el antebrazo a partir de la muñeca hasta el codo en concentraciones ascendentes por cada voluntario.
Los ensayos se realizaron rociando inicialmente aceite mineral (blanco) en el brazo izquierdo y tras dejar que este se impregnara bien en la piel, se pidió a cada voluntario ingresar el brazo tratado a la jaula entomológica durante un tiempo mínimo de 30 segundos evitando mover el brazo. Bajo estas condiciones la tasa de picadura debía ser superior a 2 aterrizajes o picaduras en un periodo de 30 segundos, sin superar 10 picaduras o aterrizajes, pues en este caso se tendría que finalizar el bioensayo, teniendo en cuenta los lineamientos que nos proporciona la OMS.
Al antebrazo izquierdo tratado se le aplicó el repelente experimental del extracto de Citronella diluido en aceite mineral a una concentración inicial del 10% y se dejó impregnar bien a la piel; luego, se introdujo nuevamente a la jaula por otro periodo de 30 segundos (ver figura 10) donde se observó el número de mosquitos que aterrizaban o picaban.
Figura 10. Bioensayos Fuente: Las autoras
Este proceso se realizó para cada concentración teniendo en cuenta que la concentración aplicada era acumulable. Finalmente se realizó el control de verificación rociando aceite mineral en el antebrazo derecho y se observó que los aterrizajes o picaduras fuera mayor o igual a 2.
Posteriormente para determinar el tiempo completo de repelencia, se tomó como base la fórmula de tiempo completo de protección, la cual se realizó con los mismos 10 voluntarios a los cuales se les aplicó la concentración que tuvo mayor repelencia en la prueba, realizándose el mismo procedimiento mencionado anteriormente con reintroducciones cada 30 minutos y se suspendía la prueba cuando hubiera picaduras o posaduras de 2 o más mosquitos en un lapso de 30 segundos.
Para comparar el tiempo completo de protección del repelente oleoso de Citronella frente al repelente comercial con el fin de verificar la efectividad del repelente oleoso de Citronella se utilizaron ambos antebrazos de cada voluntario, primero el izquierdo con el extracto a la con
comercial en base alcohólica registrando los tiempos de protección de cada uno de ellos (Organización mundial de la salud, 2009).