3. Missionaries and Development in Mexico
3.3. Data Sources and Data Set Construction
Para el estudio fitoquímico de las partes aéreas de la especie Momordica charantia se emplearon métodos cromatográficos, espectroscópicos y espectrométricos convencionales utilizados en el aislamiento, purificación y elucidación estructural de metabolitos secundarios.
Métodos de separación cromatográficos y elucidación estructural Los extractos y fracciones obtenidos fueron sometidos a separaciones sucesivas empleando para ello cromatografía en columna (CC) bajo gravedad, cromatografía en capa delgada (CCD) y cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP); cada una de las sub-fracciones obtenidas se monitorearon por cromatografía en capa delgada (CCD) utilizando cromatoplacas en sílica gel 60G F-254 Merck y para la CC se utilizó sílica gel 60 Merck (60- 200 Mesh).
El perfil cromatográfico de la CCD y la cantidad de fracción, permitió la selección de las fracciones que se llevaron a purificación, donde el control de pureza se realizó por CCD empleando como reveladores luz ultravioleta y vainillina en ácido sulfúrico.
Para determinar las mezclas obtenidas en las diferentes fracciones se utilizó un cromatógrafo con detector selectivo de masas SHIMADZU QP2010 plus, dotado con sonda de inserción directa y analizador de masas cuadrupolar. Utilizando un modo ionización electrónica (IE) a 70eV y una temperatura de la cámara de ionización de 230°C, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad
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Distrital Francisco José de Caldas. La separación se realizó en una columna capilar SHRXi-5MS de 30 metros de ongitud 0,25 mm 0,25 μm con una inyección en modo Splitless, el gas de arrastre utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La programación de la temperatura del horno fue: de 50 °C (2 min) a 15°C/min hasta 200°C (2 min) a 10°C/min hasta 300°C (10min) para un tiempo total de análisis de 34 minutos, la temperatura de la línea de transferencia fue de 275°C y de la cámara de ionización de 230°C.
Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
Los compuestos obtenidos fueron analizados por RMN (1H, 13C, J-MOD) tomados en un espectrómetro Bruker Avance del laboratorio de RMN de la Pontificia Universidad Javeriana. Los análisis se realizaron a 75 MHz para 13C y 300 MHz para 1H, empleando como solvente deuterado Metanol-d
4, con tetrametilsilano (TMS) como referencia interna.
6.2 Estudio fitoquímico de las partes aéreas de Momordica charantia L A continuación, se muestra la metodología que se empleó en la identificación de la especie vegetal, la obtención de extractos y fracciones, el aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios fijos.
Recolección e identificación del material vegetal
La especie vegetal fue recolectada en el municipio de Honda - Tolima (Coordenadas geográficas: 5°11′ 29′′ N, 74° 44′ 36′′ O) como se observa en la Figura 6-1.
Se recolectaron 500 g de partes aéreas, las cuales se secaron a temperatura ambiente y se redujeron de tamaño para su posterior extracción, una muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de Colombia para su determinación taxonómica la cual fue clasificada como Momordica charantia bajo el código COL 596915, identificada por el biólogo Carlos Alberto Parra.
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Figura 6-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie
Momordica charantia, Colombia (Tolima) municipio de honda.
*Departamento Tolima, Municipio Honda. Adaptado de http://www.honda- tolima.gov.co/calendario/mapas_municipio.shtml?apc=bcxx-1-&x=1950707
Marcha fitoquímica preliminar
Para el estudio y caracterización de los metabolitos secundarios mayoritarios, se preparó un extracto etanólico, por medio de maceración en frio con 50 ml de etanol al 96%, empleando 10 g de partes aéreas secas de la especie vegetal
Momordica charantia. A partir de este extracto se procedió a realizar las diferentes pruebas de identificación utilizando controles positivos para cada grupo de metabolitos presentes en la especie vegetal. El análisis se realizó basado en la guía de análisis fitoquímico preliminar (Sanabria, 1983) y en el método de estudio de productos naturales (Lock de Ugaz, 1994), tal como se muestra en la Figura 6-2.
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Figura 6-2 Diagrama de la marcha Fitoquímica preliminar (Sanabria, 1983) y (Lock de Ugaz, 1994).
Obtención del extracto etanólico de las partes aéreas Momordica charantia (E. EtOH.Mc.PA)
La preparación del extracto se realizó con 500 g de material vegetal seco y molido de partes aéreas de la especie Momordica charantia empleando 2400 mL de EtOH al 96% a temperatura ambiente utilizando la técnica por maceración en frio. El extracto etanólico obtenido se filtró y concentro a una presión reducida a una temperatura de 40°C, posteriormente se floculó con H2O en relación 1:1 (E. EtOH.Mc.PA:H2O) con el fin de eliminar interferencias e impurezas, posteriormente se realizó el fraccionamiento liquido-liquido continuo. El porcentaje de rendimiento neto que presento la extracción por maceración en frio con EtOH fue del 7.4 % p/p.
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6.2.3.1 Obtención de Fracciones (Fx) totales
El extracto etanólico (E. EtOH.Mc.PA) fue empleado para el fraccionamiento liquido-liquido continuo, utilizando solventes de polaridad creciente; a partir de esto fueron obtenidas las fracciones de heptano (Fx.Hept.Mc.PA 450mg (1.22%)), diclorometano (Fx.DCM.Mc.PA 3152.2mg (8.51%)), acetato de etilo (Fx.AcOEt.Mc.PA 377.9mg (1.02%)) y un residuo hidroalcohólico (Fx.Hidroalc.Mc.PA (89.25%)). El proceso de fraccionamiento y los porcentajes de rendimiento para cada fracción se observan en la Figura 6-3.
Figura 6-3Diagrama general del extracto y fracciones de partes aéreas de la especie Momordica charantia.
Fx.Hidroalcolica.Mc.PA (1200 mg) 89.25% 500 g Material vegetal seco y Molido
de Partes aéreas de Momordica charantia
Macerado en frio con EtOH al 96%
Obtención E.EtOH.Mc.PA 7.4%
Floculación de E.EtOH.Mc.PA sistema EtOH :H2O 1:1 Fx.Hep.Mc.PA (450 mg) 1.22% Fraccionamiento Liquido- Liquido Continuo Fx.DCM.Mc.PA (2000 mg) 8.51% Fx.AcOEt.Mc.PA (350 mg) 1.02%
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6.2.3.2 Fracción heptano de las partes aéreas de Momordica charantia (Fx.Hep.Mc.PA)
350 mg de Fx.Hep.Mc.PA fueron fraccionados por CC utilizando como fase móvil Hexano: Acetona 7:3, obteniendo 40 fracciones de las cuales fueron reunidas en 5 subfracciones. En la subfracción 9 (Fx9.Hept Mc .PA) se obtuvieron 30.9 mg de un sólido color amarillo denominado Mezcla McPA1, esta fracción fue analizada por CG-EM.
6.2.3.3 Fracción diclorometano de partes aéreas Momordica charantia (Fx.DCM.Mc.PA)
1000 mg de la fracción Fx.DCM.Mc.PA fue fraccionada por CC empleando como fase móvil CHCl3: Acetona 7:3 obteniendo 90 fracciones las cuales después de ser monitoreadas por CCD fueron reunidas en 22 fracciones. De la fracción 18 (Fx18.DCM Mc.PA) se obtuvo 156 mg de un sólido color amarillo-verdoso denominado Mezcla McPA2. De la fracción 21 (Fx21.DCM Mc.PA) se obtuvo 100 mg de un sólido color amarillo denominado Mezcla McPA3 , por último, en la fracción 30 (Fx30.DCM Mc.PA) se obtuvieron 100 mg de un sólido color amarillo al cual se le realizo CCDP empleando como fase móvil CHCl3: Acetona 1:1 empleando como revelador vainillina en H2SO4 y Luz ultravioleta obteniendo 3 subfracciones, de las cuales solo la subfracción 2 (Fx30.2 DCM Mc.PA) fue estudiada obteniendo 88.7mg de un sólido color blanco denominado Mezcla McPA4 siendo analizadas las fracciones y subfracciones por CG-EM.
6.2.3.4 Fracción de Acetato de Etilo de partes aéreas Momordica charantia (Fx.AcOEt.Mc.PA)
2,5 mg de la Fx.AcOEt.Mc.PA, fue fraccionada por el método de CC empleando como fase móvil Acetonitrilo: Metanol 8:2, obteniendo 25 fracciones las cuales después de ser monitoreadas por CCD utilizando cromatoplacas de aluminio en sílica gel RP18 Merck fueron reunidas a 5 fracciones. De la fracción 1 (Fx1.AcOEt Mc.PA) se obtuvo 18.3 mg de un cristal amarillo denominado Compuesto McPA5 el cual fue analizado por RMN.
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6.2.3.5 Fracción Hidroalcohólica de partes aéreas Momordica charantia (Fx.Hidroalc.Mc.PA)
1000 mg de la Fx.Hidroalc.Mc.PA fueron separados por el método CF utilizando el equipo isoleraTM Biotage, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Empleando como fase móvil Metanol: Agua 8:2 y un cartucho SNAP Ultra C18 60g. Se obtuvo 70 fracciones las cuales fueron monitoreadas por CCD empleando cromatoplacas de aluminio en sílica gel RP18 Merck utilizando como fase móvil Metanol: agua 9:1 reunidas a 30 fracciones. De la fracción 6 (Fx6.Hidroalc Mc.PA) se obtuvo 38.5 mg de un cristal amarillo con punto de fusión de 222°C denominado Compuesto McPA6 el cual fue analizado por RMN.
La metodología empleada para el aislamiento de las mezclas y compuestos obtenidos de las fracciones de partes aéreas de Momordica charantia se ilustran en la Figura 6-4.
Figura 6-4 Aislamiento y purificación de las mezclas y compuestos.
Fx.Hep.Mc.PA 350 mg 40 fracciones CC Hex:Acetona 7: 3 CCD DCM : Acetona 6:4 5 subfracciones (30.9 mg) Sólido Amarillo Mezcla McPA1 CG-EM Fx.5.Hep.Mc.PA F.DCM.Mc.PA 1000 mg CC CHCl3:Acetona 7:3 90 fracciones CCD CHCl3: Acetona 7:3 Fx10.DCM Mc.PA (156mg) Sólido Amarillo Mezcla McPA2 Fx18.DCM Mc.PA (100mg) Sólido Amarillo Mezcla McPA3 Fx 21.DCM Mc.PA (200mg) Sólido Amarillo Fxs 21. 2.DCM Mc.PA (88,5mg) Sólido Blanco Mezcla McPA4 CG-EM 2 subfracciones 22 subfracciones CCDP CHCl3:Acetona 1:1 F.AcOEt.Mc.PA 250 mg CC Acetonitrilo: Metanol 8:2 25 fracciones 5 subfracciones Fx1.AcOEt.Mc.PA (38.3 mg) Cristales Amarillos Compuesto McPA5 RMN CCD Acetonitrilo: Metanol 6:4 Fx.Hidroalc.Mc.PA 1000 mg 70 fracciones CF Metanol:Agua 8:2 CCD Metanol:Agua 9:1 30 subfracciones (50.2 mg) Cristales Amarillos Compuesto McPA6 RMN Fx6.Hidroalc.Mc.PA
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Evaluación de la Capacidad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS
6.2.4.1 Preparación de la solución de DPPH
Para el ensayo se preparó la solución del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo disolviendo 10mg de (DPPH•) en 10ml de metanol grado analítico. La solución fue protegida totalmente de la luz para evitar su degradación.
6.2.4.2 Cuantificación de la capacidad antioxidante en DPPH
Se evaluó de forma cuantitativa la capacidad que tienen los diferentes extractos y compuestos antioxidantes para neutralizar un radical libre, para este estudio se empleó el compuesto DPPH el cual se caracteriza por ser un radical estable gracias a la deslocalización de su electrón libre y su color violeta oscuro que posee una banda de absorción a 520nm, permitiendo determinar las concentraciones optimas de inhibición mediante métodos espectrofotométricos. Cuando una solución de DPPH se mezcla con una solución donadora de protones como un antioxidante, el radical se reduce perdiendo la intensidad de color y su absorbancia (Jara, 2013).
Se realizaron lecturas del ensayo para la capacidad antioxidante por triplicado utilizando placas excavadas con un tota de 96 pozos de 300 μL c/u. Se prepararon concentraciones stock para cada una de las fracciones a 10000 ppm, para cada ensayo se realizaron diluciones en serie de 9000, 6000, 3000, 1000, 500 y 100 ppm a 25 μL de cada uno se agregó 275 μL de solución DPPH y se leyó su absorbancia a 520 nm, en un equipo FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH ubicado en el laboratorio de química de la Pontificia Universidad Javeriana, Las absorbancias se registraron teniendo en cuenta intervalos de tres minutos ente 0 y 60 min respectivamente. Se utilizó un control de trolox en solución metanólica, siguiendo el protocolo descrito en la Figura 6-5, el porcentaje de inhibición del radical DPPH, se calculó utilizando la ecuación 1:
% de inhibición del DPPH=(𝐴𝐵−𝐴𝐴)
𝐴𝐵 ∗ 100
42 Donde:
AB corresponde a la absorbancia del blanco
AA corresponde a absorbancia del antioxidante
6.2.4.3 Preparación de la solución de ABTS
El radical catiónico ABTS●+ se produjo mediante la reacción entre ABTS 20 mg
en agua desionizada y persulfato de potasio 2.4mg, almacenado en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16h debido a la alta sensibilidad a la luz.
6.2.4.4 Cuantificación de la capacidad antioxidante en ABTS
El ensayo ABTS●+ se basa en la transferencia de electrones; por lo cual los diferentes compuestos antioxidantes presentes en los extractos, donan uno o dos electrones para reducir el radical catión generando una medida precisa de la capacidad antioxidante total en el punto final de reacción (Wootton-Beard et al., 2011). Este catión radical ABTS azul posee una banda de absorción en 734nm volviéndose una solución incolora en presencia de antioxidantes, permitiendo así determinar las concentraciones óptimas de inhibición mediante métodos espectrofotométricos.
Se realizaron lecturas del ensayo para la capacidad antioxidante por triplicado uti izando p acas e cavadas con un tota de 96 pozos de 300 μL c/u. Se prepararon concentraciones stock para cada una de las fracciones a 10000 ppm, para cada ensayo se realizaron diluciones de 9000 6000, 3000, 1000, 500, 100 ppm, continuando con el mismo protocolo empleado en la medición por DPPH. El porcentaje de inhibición del radical ABTS, se calculó a partir de la ecuación 2:
% de inhibición del ABTS=(𝐴𝐵−𝐴𝐴)
𝐴𝐵 ∗ 100
Ecuación 2. Cálculo % de inhibición ABTS Donde:
43 AB corresponde a la absorbancia del blanco
AA corresponde a absorbancia del antioxidante
En la figura 6-5 se describe el procedimiento empleado para la evaluación de la capacidad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS.
Figura 6-5 Protocolo utilizado para el control de Trolox en los métodos de ABTS y DPPH
6.2.4.5 Análisis estadístico para los métodos de DPPH Y ABTS
El análisis estadístico para la cuantificación de la capacidad antioxidante (% inhibición y IC50), se realizó para el extracto etanólico y las fracciones de las partes aéreas de Momordica charantia, de acuerdo a los reportes establecidos
A partir de un stock de 200 ppm de Trolox
A partir de un stock de 200 ppm de Trolox
Método DPPH Método ABTS
En solución metanólica Di uciones a 20, 60 y 100 ppm Se preparo Se preparo Diluciones a 60, 75 y 125 ppm se agregó 275 μL de so ución DPPH y 25 μL de cada dilución Se eyó a absorbancia en un equipo L Ostar OP M BM L B ECH ubicado en e aboratorio de química de a Pontificia niversidad averiana se agregó 275 μL de so ución B S y 25 μL de cada dilución a 520nm a 734nm
Tres minutos entre 0 y 60 min Dos minutos entre 0 y 60 min
En intervalos de En intervalos de
gua desionizada
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por triplicado (n=3), donde se estableció coeficientes de correlación y análisis de varianza, para cada ensayo utilizando el programa de statgraphics centurion XVI.
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