AIRCRAFT DECON
Station 2 Decon-Solution Application
5. 1. Efecto del polvo de aceituna en medio de referencia BHI y bebida vegetal
Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de polvo de aceitunas (0, 1,5, 2,5 y 5%) en el crecimiento y supervivencia de B. cereus incubado a 7, 20 y 32 ºC. La figura 5.1 muestra las curvas de crecimiento de B. cereus a las diferentes temperaturas de estudio en presencia de 2,5% de polvo de aceitunas, concentración recomendada por los fabricantes. El polvo de aceitunas mostró un efecto bacteriostático, ya que tras 24 horas de almacenamiento el crecimiento fue menor en las muestras con polvo de aceitunas, que en aquellas que no contenían dicho ingrediente, para todas las temperaturas y concentraciones (tabla 5.1). En general se observó un mayor crecimiento a 32 ºC que a 20 y 7 ºC para todas las concentraciones de polvo de aceitunas debido a que esta temperatura es muy cercana a la óptima del microorganismo. Del mismo modo, a todas las temperaturas se observó un menor crecimiento con el tiempo de incubación al aumentar la concentración de polvo de aceitunas, si bien las diferencia observadas fueron mayores a la temperatura más baja. 7ºC, es una temperatura tan baja que apenas hubo crecimiento de B.cereus, sin embargo la reducción microbiana fue mayor que en las muestras que contenían el polvo de aceitunas. Esto indica que aunque la temperatura fue muy baja el polvo de aceitunas tuvo un efecto de control lo cual tiene relevancia en los procesos de conservación de alimentos en refrigeración. Estos resultados concuerdan con los observados por Tassou et al., (1991) quienes observaron una inhibición de la germinación y crecimiento de esporas de B. cereus
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60 tiempo (h) L o g N ( U F C /m l) 7ºC 20ºC 32ºC
Figura 6. 1. Ejemplo de curvas de crecimiento al 2.5 % de polvo de aceituna a las diferentes temperaturas estudiadas
Tabla 6.1. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (Log N (UFC/ml)) en medio de referencia a diferentes temperaturas y concentraciones de polvo de aceitunas tras 24 horas de almacenamiento
Concentración polvo de aceitunas (%)
T (ºC) 0 1.5 2.5 5
32 8,20 a2 ± 0,01 8,20 a1 ± 0,04 8,12 ab1 ± 0,05 8,02 b1 ± 0,07
20 8,72 a1 ± 0,04 7,80 b1 ± 0,04 7,48 c2 ± 0,02 6.0 d2 ± 0,3
7 5,8 a3 ± 0,1 4,7 d2 ± 0,4 5,13 b3 ± 0,04 4,83 bc3 ± 0,05
1-3: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d: valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la
misma temperatura
Posteriormente se modelizó el crecimiento y la cinética de inactivación de B. cereus en presencia de polvo de aceitunas, los datos experimentales fueron ajustados a la ecuación de
Gompertz modificada (ecuación 1) descrita en materiales y métodos, utilizando el programa estadístico Statgraphics plus XV.
La ecuación de Gompertz ha sido utilizada en diversas investigaciones para diferentes microorganismos (McKellar y Lu, 2004). Chorin y et al., (1997) utilizaron este modelo para describir el crecimiento de B. cereus en caldo BHI.
La tabla 6. 2 muestra los valores medios y la desviación estándar para la velocidad específica de crecimiento μmax y la fase de latencia λ. En el caso de µmax, el análisis ANOVA
indicó diferencias significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre los valores de µmax a las distintas temperaturas para cada concentración de polvo de aceitunas,
excepto en el control, donde no se añadió polvo de aceitunas. A 32 ºC el análisis ANOVA indicó que no hubo diferencias significativas entre las concentraciones, excepto al 1,5 y 2,5% de polvo de aceituna. A 20 ºC, el análisis indicó diferencias significativas (p<0.05) entre todas las concentraciones excepto entre 1,5 y 2,5%. De acuerdo con estos resultados, la concentración de polvo de aceitunas no afecta a la velocidad de crecimiento del B. cereus a la temperatura óptima de crecimiento (32 ºC) utilizada en este estudio. Sin embargo, a 20 ºC, que puede ser considerada como una temperatura de rotura de la cadena de frío, se observó una disminución del valor µmax al aumentar la concentración del
ingrediente comparado con el control, al que no se le añadió el ingrediente.
Respecto a los valores medios y la desviación estándar para el factor de latencia (λ, tabla 6. 2), el análisis de la varianza para las distintas condiciones del estudio indicó que hubo diferencias significativas entre 0 y 1,5% de polvo de aceitunas a 32 y a 20 ºC. En general, al aumentar la concentración de polvo de aceitunas aumentó el factor de latencia. La fase de latencia es el periodo durante el cual las células se modifican para poder iniciar el crecimiento exponencial. Desde el punto de la vista de la seguridad alimentaria, ese aumento en la fase de latencia es importante por ejemplo en caso de que se interrumpa la cadena de frío, ya que las fluctuaciones de temperatura son un factor importante en la conservación de los alimentos. Una manera de simular una interrupción de la cadena de frío, por ejemplo en muchos lugares de Colombia la temperatura ambiente sobrepasa los 20 ºC, o bien no se utilizan condiciones de almacenamiento a bajas temperaturas, de esta
manera la presencia de polvo de aceitunas permitiría mantener la población de B.cereus en niveles considerados seguros, en caso de condiciones inadecuadas. Es razonable decir que a temperaturas desde 8 hasta 12 ºC el comportamiento de B.cereus en presencia de polvo de aceitunas es similar a temperaturas de almacenamiento mayores. Medidas en la temperatura de refrigeradores de uso doméstico en Europa, muestran que los alimentos son almacenados a temperaturas no adecuadas (≥9 ºC) (Sergelidis et al., 1997; Bakalis et al., 2004). Estas determinaciones de la temperatura sugieren la necesidad de aplicar barreras como la adición de ingredientes con propiedades bacteriostáticas o bactericidas en alimentos que requieren refrigeración.
Tabla 6. 2. Valores medios y de desviación estándar para la tasa máxima de crecimiento (µmax) y la fase de latencia (λ) a diferentes condiciones de estudio en medio
de referencia
Tasa máxima de crecimiento específico (µ ) Fase de Latencia (λ) Temperatura Temperatura 32ºC 20ºC 32ºC 20ºC 0 0.56 ab ± 0.08 0.50 a ± 0.03 1.5 c2 ± 0.1 5.8 c1 ± 0.7 1.5 0.473 b1 ± 0.006 0.183 c2 ± 0.006 1.6 c2 ± 0.2 5.9 c1 ± 0.2 2.5 0.59 a1 ± 0.08 0.133 c2 ± 0.006 3.5 b2 ± 0.2 8.3 b1 ± 0.6 5 0.55 ab1 ± 0.04 0.28 b2 ± 0.09 9.5 a2 ± 0.7 21.05a1 ± 2.4
1-3: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d: valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la
misma temperatura
El efecto bacteriostático del polvo de aceitunas se observó también en la bebida de vegetales, respecto a la concentración 2,5 % de polvo de aceitunas se encontró un efecto de
control sobre el crecimiento de B. cereus desde la hora 6 hasta la hora 54 para las dos temperaturas de almacenamiento (figura 2 y 3) La causa probable del incremento de la concentración de microorganismos es la recuperación de algunas células que sufrieron daño por parte del polvo de aceitunas y que la temperatura de 32 ºC es cercana a la temperatura óptima de B. cereus. Por otra parte la concentración de 1.5% mostró también un efecto de control sobre B. cereus a 20 ºC de almacenamiento (figura 4). En la figura 5 se observa una diferencia con respecto al control a 32 ºC el comportamiento de B. cereus fue diferente en presencia de 1,5 % de polvo de aceitunas, la curva correspondiente al polvo de aceitunas creció más que el control, esto debido probablemente a que 32 ºC es una temperatura muy cercana a la óptima al microorganismo, o bien que 1,5% de polvo de aceituna no es suficiente para disminuir el número de microorganismos a una temperatura de abuso extremo en materia de almacenamiento como lo son 32 ºC.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60 tiempo (h) L o g N ( U F C /m l)
sin polvo de aceitunas 2,5% polvo de aceituna
Figura 6. 2. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceitunas y con una concentración del 2,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 tiempo (h) L o g N ( U F C /m l)
sin polvo de aceitunas 2,5% polvo de aceituna
Figura 6. 3. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una concentración del 1,5% almacenado a una temperatura de 32 ºC. 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 0 10 20 30 40 50 60 tiempo (h) L o g N ( U F C /m l)
sin polvo de aceituna 1,5%polvo de aceituna
Figura 6. 4. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una concentración del 1,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 0 10 20 30 40 50 60 tiempo (h) L o g N ( U F C /m l)
sin polvo de aceituna 1,5% polvo de aceituna
Figura 6. 5. Curva de crecimiento de fracción de B.cereus Log N (UFC/ml), comparando con el control en presencia de 2.5% de polvo de aceituna a 32 ºC de almacenamiento.
Los resultados del análisis ANOVA (Tabla 3) muestran que existen diferencias significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre las concentraciones de polvo de aceitunas de 0, 1,5 y 2,5%, no obstante no hay diferencias significativas entre las temperaturas de almacenamiento 20 y 32 ºC. Los recuentos correspondientes a la temperatura 20 ºC en presencia de 1,5% de polvo de aceituna muestran una desviación estándar mayor que en los demás experimentos pero aún así se aprecia un efecto de control bajo estas condiciones.
Tabla 6. 3. Valores medios y desviación estándar de logaritmo de la fracción de recuentos de B. cereus después de 24 horas de almacenamiento a diferentes condiciones de estudio en sustrato vegetal
Temperatura de almacenamiento % Polvo de aceitunas 20ºC 32ºC 0 7.389ª1± 0,020 6,730ª1± 0,098 1.5 6.519b1± 0,051 6,568b1± 0,126 2.5 6.441c1± 0.069 4.852c1± 0.057
1-3: valores con diferentes números indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d:
valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la misma temperatura.
Las propiedades antimicrobianas de extractos de olivas han sido investigadas, Serra y col (2008) reportan que el contenido de polifenoles: quercetina, hidroxitirosal y oleuropeina tienen efecto antimicrobiano frente a B. cereus, otras dos especies de bacterias como E. coli, S. ponna y dos especies de levaduras S. cerevisiae y C. albicans. Una concentración de 500 mg/L de oleuropeina pueden inhibir considerablemente a B. cereus.
Otras investigaciones como la de Pereira et al (2007) utilizaron el extracto de olivas para evaluar su actividad antimicrobiana. La capacidad antimicrobiana de los compuesto fenólicos es conocida, pero la de los extractos pueden ser mas benéficos que los constituyentes aislados se habla entonces de un efecto sinérgico de sustancias fitoquímicas en frutas y vegetales es responsable de las propiedades bioactivas, lo cual explica porque un solo antimicrobiano no puede inhibir o controlar diferentes microorganismos.
5. 2. Efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas en medio de referencia y bebida vegetal
Se estudió el efecto del tratamiento por APH sobre las esporas de B. cereus. Los resultados obtenidos muestran que las presiones estudiadas no tienen un efecto significativo en cuanto a la reducción del número de esporas presentes en la muestra y por tanto en la población de microorganismos viables. Las figura 6,6, 6,7 y 6,8 muestra el efecto de las APH solas sobre el número de microorganismos
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 200 400 500 Presión (MPa) N /N 0 MR BV
Figura 6. 6. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia bebida de vegetales a diferentes presiones sin polvo de aceitunas
200 MPa 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 0 1,5 2,5 COP (%) N /N 0 MR BV
Figura 6. 7. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas a 200 MPa 500 MPa 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0 1,5 2,5 polvo de aceituna (%) N /N 0 MR BV
Figura 6. 8. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas a 500 MPa
En la tabla 6. 4 se resume el efecto de las altas presiones y la concentración de polvo de aceituna sobre la población de B. cereus en los diferentes sustratos, medio de referencia y bebida vegetal. En general, tanto en el medio de referencia como en la bebida vegetal, se observan diferencias significativas (Anexos 9.1 y 9.2) debidas a la concentración de polvo de aceituna (p<0,01) que indican una mayor supervivencia de las esporas a mayores concentraciones de polvo de aceituna. En cuanto al efecto de la presión, también es significativo (p<0,001) en ambos sustratos, observándose generalmente una menor inactivación de las esporas de B. cereus a la presión de 400 MPa. Sin embargo, debido al efecto de la interacción entre presión y concentración de polvo de aceituna (p<0,001) estos
efectos no se observan con claridad en todas las combinaciones de presión y polvo de aceituna
Tabla 6. 4. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (N/N0),
en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a tratamiento por APH a 200, 400 y 500 MPa (10 min) y con diferentes concentraciones de polvo de aceitunas
Altas Presiones Hidrostáticas
% P.A Medio de referencia Bebida vegetal
200 400 500 200 400 500 0 0,592 ±0,24 1,02ab1±0,14 0,73b12±0.28 0,54a2±0,15 0,84a1±0,05 0,40b2±0,06 1.5 0,901± 0,02 0,84b2± 0,01 0,61b3±0,05 0,29b2± 0,10 0,30b2± 0,06 0,59a1± 0,05 2.5 0,892± 0,02 1,13a1 ± 0,11 1,10a1±0,19 0,38ab2±0,12 0,68ab1±0,18 0,43b12±0,03 P *** *** CPA *** ** Px CPA *** ***
1-3: valores con números diferentes indican diferencias significativas efecto de las diferentes
presiones a la misma concentración de polvo de aceituna y en el mismo substrato.
a-c
: valores con letras diferentes indican diferencias significativas defecto de las diferentes concentraciones de polvo de aceitunas a la misma presión y en el mismo substrato.
P: efecto de la presión, CPA: efecto de la concentración de polvo de aceituna, PxCPA: efecto de la interacción entre la concentración de polvo de aceituna y las altas presiones. ***: p<0.001, **: p<0.01.
Los resultados referentes al efecto de la presión obtenidos en este estudio coinciden con los de otros autores que observaron que a presiones relativamente bajas se puede inducir la germinación de las esporas (Rasso et al., 1998), así podría ser que la mayor inhibición observada a 200 MPa pudiera ser debida a la germinación de las esporas que se transformarían en células vegetativas, volviéndose más sensibles al tratamiento por APH. Por otra parte, 500 MPa es una presión alta que sí puede afectar a las esporas y disminuir su supervivencia, sin embrago estas disminuciones no garantizan la calidad microbiológica de la bebida de vegetales ya que son menores de un ciclo logarítmico. En cuanto al efecto de la concentración de polvo de aceituna, los resultados parecen indicar un posible efecto protector en el tratamiento por APH, que podría ser debido al efecto inhibidor de la germinación, anteriormente descrito para este ingrediente (Tassou et al., 1991). Sin embargo, este efecto podría ser de interés durante la vida útil del producto, por tanto sería
necesario estudiar la evolución de los diferentes sustratos a lo largo del periodo de almacenamiento.
La figura 6. 9. permite observar las diferencias en la población de B. cereus debidas a los diferentes sustratos. En general, a todas las presiones se puede observar que, en ausencia de polvo de aceituna no hay diferencias significativas entre el número de esporas viables en el medio de referencia y la bebida vegetal, sin embargo al 1,5 y 2,5% de polvo de aceituna se observa que la supervivencia de las esporas es mayor en el medio de referencia que en la bebida vegetal. Esto pueda deberse probablemente a que el comportamiento de algunos microorganismos en sustratos vegetales muestran que algunos alimentos pueden tener un efecto protector propio innato contra microorganismos, esto puede ser debido a los componentes naturales como fitoatoalexinas presentes fluidos celulares y vasculares son liberados a consecuencia del rompimiento de las células de zanahoria durante un tratamiento como el de Altas Presiones (Pilavtepe-Çelik1 et al., 2008), estos resultados son relevantes en comparación con los obtenidos en este estudio ya que las fitoalexinas están presentes en la zanahoria del sustrato vegetal.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 200 400 500 Presión (MPa) N /N 0 0 1,5 2,5 BV 0% BV 1,5% BV 2,5%
Figura 6. 9. Efecto de la presión y la concentración de polvo de aceitunas sobre la población de B. cereus en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a 10 min de tratamiento con APH.
La temperatura de tratamiento en Altas Presiones es un factor importante así, con temperaturas superiores a los 40 ºC pueden inactivar hasta un ciclo completo a 100 MPa para esporas de B. cereus (Black et al., 2008).
El sustrato en el cual se realizan los tratamientos puede influir en la inactivación de los microorganismos, en alimentos por ejemplo los microorganismos son más resistentes a la presión que en sistemas de referencia como búferes (Alpas et al., 2003; Chen y Hoover 2003; Van, Opstal et al., 2005); así la composición del medio de referencia puede estar relacionada con la resistencia del microorganismo a las APH, así algunos aminoácidos como la glicina y la betaina (presente en el BHI) puede actuar como agente osmoprotector impidiendo que la membrana de las células se vea afectada por las APH (Jofré et al., 2007). La bebida de vegetales de este estudio tiene una composición sencilla (zanahorias y judías verdes) presento un pH de 6.32 muy cercano a la neutralidad de tal manera que el pH del sustrato no es una barrera extra contra microorganismos.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 200 400 500 Presión (MPa) N /N 0 0 1,5 2,5 BV 0% BV 1,5% BV 2,5%
Figura 6. 10. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre dos tiempos de tratamiento con APH diferentes.
5. 3. Efecto del tiempo de tratamiento con APH en la bebida de vegetales
El tiempo y la temperatura son factores clave a la hora de aplicar cualquier tecnología para disminuir carga microbiana. Otros autores han observado que un incremento del tiempo de tratamiento con APH conduce a un aumento en la inactivación de células vegetativas (Bellaterra, 2004). En este estudio se consideró alargar el tiempo de tratamiento a 25 minutos para ver si esto tendría un efecto mayor sobre las esporas de B. cereus. En la figura 6. 11. se pueden observar los resultados en la bebida vegetal tras tratarla con APH durante 10 y 25 min. Como se ve en la figura no se observaron diferencias significativas debidas al tiempo de tratamiento.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 200 400 Presión (MPa) N /N 0
10 min, 0% 25 min, 0% 10 min, 1.5% 25 min, 1,5% 10 min, 2,5 % 25 min, 2,5%
Figura 6. 11. Efecto del tiempo de tratamiento con APH sobre la población de B. cereus (N/N0) en bebida vegetal a las diferentes presiones y concentraciones de polvo
de aceitunas estudiadas
En la tabla 6.5 se pueden apreciar En general, tanto en el medio de referencia como en la bebida vegetal, no se observaron diferencias significativas en respuesta al aumento del tiempo de tratamiento a Altas Presiones ni a la concentración de polvo de aceituna (p>0,001) y (p>0,01) respectivamente (anexo 9.3 ). Para esta experiencia se sigue observando una leve disminución de la carga microbiana para la presión de 200 MPa porque el polvo de aceitunas puede inhibir en algún grado la germinación de las esporas.
Tabla 6. 5. Valores medios y desviación estándar de Log N/No de B. cereus, después de 24 horas de almacenamiento en sustrato vegetal con APH con dos tiempos de tratamiento a APH
Tratamiento 10 min Tratamiento 25min
% P.A 200MPa 400Mpa 200MPa 400Mpa
0 0.59± 0.24 1.02± 0.14 0.20 ±1,09 1.06± 0.59
1.5 0.90± 0.02 0.84± 0.01 0.61 ±1,09 0.49± 0.11 2.5 0.89± 0.02 0.68± 0.12 0.22 ±1,09 0.66± 0.08
Esta tabla solo presenta datos de medias y desviaciones estándar, porque no hay diferencias significativas.
6. CONCLUSIONES
Mediante los datos obtenidos para las diferentes concentraciones de polvo de aceitunas en medio de referencia y en sustrato vegetal se puede decir que el polvo de aceitunas en concentraciones de 1.5 % ó de 2.5%, se puede utilizar como aditivo en alimentos para
controlar B. cereus junto a otros sistemas de preservación físicos como almacenamiento a bajas temperaturas.
A las temperaturas de almacenamiento 20 y 32ºC el polvo de aceitunas mostró una capacidad de controlar poblaciones de B. cereus, lo cual es importante en caso de que se interrumpa la cadena de frío de un alimento o bien hayan problemas durante el transporte de la bebida de vegetales.
El tratamiento de APH no tuvo influencia importante sobre el número de reducciones de B. cereus en medio de referencia y sustrato vegetal. En consecuencia, la tecnología de APH sola o combinada con el polvo de aceituna no fue suficiente para garantizar la seguridad microbiológica de la bebida de vegetales.
Un aumento en el tiempo de tratamiento tampoco mostró una disminución importante en el número de microorganismos.
La temperatura de tratamiento del estudio fue para todo los ensayos 20 ºC, dicha temperatura se considera baja, puesto que las esporas son termorresistentes, con lo cual se indujo la germinación pero no la destrucción significativa de esporas de B. cereus
7. RECOMENDACIONES
Se considera necesario pensar en un efecto conjunto de las APH y el ingrediente, para controlar al B. cereus durante el almacenamiento; es decir, estudiar la influencia de los tratamientos con APH´s, una concentración de 2,5% de polvo de aceitunas y los
componentes de la bebida (sustancias fotoquímicas) a través del tiempo a diferentes condiciones de almacenamiento.
Como se menciono en la discusión de resultados, la temperatura de tratamiento influye en la reducción de microorganismos, un aumento de la temperatura de tratamiento junto con las APH y la adición del polvo de aceitunas pueden inhibir el crecimiento de Bacillus cereus o mantenerlo bajo niveles que no causen deterioro en la bebida vegetal ni nocivos para el consumidor.
En materia de seguridad alimentaria es importante tener en cuenta la manipulación de los alimentos durante su preparación, sí se mantienen condiciones de higiene, Buenas Prácticas de Manufactura se puede disminuir el riesgo de contaminación en los alimentos. En muchas ocasiones se piensa que una tecnología muy avanzada garantiza seguridad microbiológica, pero si no se manejan condiciones aptas durante el proceso de preparado de un alimento cualquiera será más difícil garantizar calidad y alargar la vida útil de un producto.