Dedicated Cameras Systems

Las extracciones de sangre a los diferentes pacientes, se realizaron con vacutainer en tubos con EDTA como anticoagulante y tubos con gel para la obtención de suero.

7.2. Hemocultivo

Para comprobar la presencia de levaduras en sangre se tomó 200 µl y 4 ml de sangre de los tubos con EDTA y se sembraron en placas con YEPD y en medio YEPD de aislamiento respectivamente. Se incubaron durante al menos una semana a 32ºC.

7.3. Obtención de suero

Para obtener el suero de la sangre de los diferentes pacientes se tomaron los tubos con gel y se centrifugaron durante 10 minutos a 2.500 r.p.m. Posteriormente la fase superior o suero se dividió en alícuotas y se almacenó a -20ºC

8. Inmunofluorescencia

Para las inmunofluorescencias realizadas con la levadura C. famata, se tomó 1 ml de un cultivo de dicha levadura con D.O a 600 nm de 1,2. Se hizo un lavado con PBS sorbitol (Sorbitol 1,2 M, K2HPO4 0,1 M pH 6.2) y a continuación las levaduras se embebieron en

cloruro amónico (NH2Cl 50 mM en tapón salino PBS) durante 10 minutos. Después de tres

lavados con TPBS (Tween20 al 0,05% en tampón salino PBS), se incubaron dos horas con el anticuerpo diluido (1:500 en el caso de suero humano y 1:1500 en el caso del antisuero D21) en TPBS, con balancéo suave a 37ºC. Después de tres lavados con TPBS de 15 minutos, se añadió el anticuerpo secundario conjugado a Fluoresceína verde. Tras incubar las muestras durante media hora a temperatura ambiente en agitación, se realizaron tres nuevos lavados con TPBS.

Finalmente, las células se fijaron con llama al cubreobjetos de vidrio y los cubres se montaron con una gota de Depex-xileno sobre los portaobjetos, se dejaron secar a temperatura ambiente y se observaron en un microscopio confocal MicroRadiance de BIO- RAD.

Las inmunofluorescencias con el resto de levaduras de la especie Candida (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis y C. parapsilosis) se realizaron utilizando el kit Euroinmun siguiendo las instrucciones de la casa comercial (Análisis y genética S.L. Euroinmun)

9. Inmunomicroscopía electrónica

Para conocer la diana del antisuero de conejo D21 se puso a punto la técnica de inmunomicroscopía electrónica.

Se siguió el protocolo de Wrigth y colaboradores (1988) (Wright et al, 1988) con algunas modificaciones. Las células se fijaron durante 2 horas a temperatura ambiente con glutaraldehido 2% en tampón cacodylato 0,1 M, pH 7.2 y posteriormente se lavaron con ácido tánico 0,15% en tampón cacodylato 0,05 M, pH 7.2. Finalmente las células se embebieron en Epon (TAAB laboratorios, Berkshire, England).

Una vez se tuvieron los cortes fijados en las rejillas, éstas se humedecieron durante un minuto con PBS. A continuación las rejillas se bañaron con NH2Cl 0,5 M durante

15 minutos y se bloquearon con BSA al 1% en tampón PBS 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente se añadió el anticuerpo primario a la dilución correspondiente en leche desnatada al 1% en PBS y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados sucesivos de 7 minutos cada uno con BSA al 0,1% en tampón PBS, después de los cuales se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente acoplado a oro coloidal de 10 nm de diámetro a una dilución 1:10000 en PBS, durante 45 minutos a temperatura ambiente. Una vez realizados dos nuevos lavados de 7 minutos con PBS y un último lavado con H2O tridestilada (sumergiendo completamente la rejilla) se dejaron secar y se procedió a

su observación.

10. Análisis estadístico

Para ampliar el estudio de la relación entre enfermedades y la presencia o no de hongos en individuos que padecen dichas enfermedades se realizaron análisis estadísticos. Con estos

análisis se quiso comprobar si la relación entre las variables estudiadas (enfermedad y presencia de hongo) se debe al azar. El nivel de significación estadística considerado fue P≤0.05, es decir, cuando la probabilidad es inferior a 0,05 o lo que es lo mismo al 5%, la relación entre las variables no se debe al azar. Como la muestra era muy pequeña se utilizó el estadístico Chi-cuadrado no paramétrico para el estudio de la relación entre variables cualitativas. Para la realización de este estudio estadístico nos hemos apoyado en el software SPSS 12.0 de Apache Software Foundation.

En la figura 6 se muestra un esquema de las relaciones analizadas:

Figura 6. Esquema de las variables analizadas y grupos estudiados.

Detección de ADN fúngico mediante la técnica de PCR

anidada Detección de ADN fúngico

mediante la técnica de PCR a tiempo real o PCR cuantitativa

MUESTRA - Controles negativos no expuestos - Controles negativos expuestos - Candidiasis crónica - Azoor - Coroiditis multifocal - Coroidopatía serpiginosa - Esclerosis múltiple

Detección de anticuerpos frente a: - C. albicans

- C. glabrata - C. tropicalis

R

ESULTADOS

1. La PCR como método diagnóstico

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa o técnica de PCR es un método enzimático que permite sintetizar numerosas copias de un fragmento concreto de ADN. Para ello se emplean dos oligonucleótidos complementarios a lo que serán los extremos del producto y por tanto se requiere el conocimiento de las secuencias que flanquean la región a amplificar (Rojo, 2001). La técnica de PCR posee múltiples aplicaciones en medicina e investigación y permite abordar nuevos problemas biológicos (Rojo, 2001). Entre sus múltiples aplicaciones cabe destacar su empleo en el diagnóstico de infecciones (Mussi- Pinhata et al, 1994). En el caso de las infecciones causadas por hongos, la técnica de PCR permite diseñar procedimientos para detectar grupos de especies a partir de una secuencia nucleotídica conservada evolutivamente, o bien más específicamente, detectar de forma selectiva las secuencias nucleotídicas propias de una determinada (Hall et al, 2003; Li et al, 2003; Nishikawa et al, 1997; Nishikawa, 1999). Recientemente en nuestro laboratorio se ha creado una nueva línea de investigación que tiene como objetivo estudiar las enfermedades originadas por patógenos de origen fúngico, utilizando entre otras, la técnica de PCR como método de diagnóstico.