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La preparación de la muestra para la realización de un diagnóstico molecular puede tener un impacto muy significativo en la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo (Bretagne and Costa, 2005; Reiss et al, 2000). En general, el método de extracción de ADN debe liberar el ácido nucleico intracelular que poseen los hongos. Además también tiene que concentrar el ADN fúngico de las muestras que suele estar presente en muy pequeñas cantidades, y eliminar los deshechos, contaminantes y posibles inhibidores de la reacción de amplificación, sin degradarlo. Existen muchos protocolos de extracción de ADN fúngico para muestras clínicas, pero aún no existe un método universal óptimo. Esto plantea la necesidad de desarrollar un método de extracción de ADN adecuado a cada tipo de muestra biológica (sangre, tejido,….) para aislar el máximo de ADN fúngico.
Cada tipo de muestra biológica presenta diferentes características, por lo que se requiere de un procesamiento distinto y específico en cada caso. Así, por ejemplo, para acceder a los ácidos nucleicos de una célula fúngica es necesario un tratamiento más agresivo que en el caso de la célula sanguínea humana, debido a que la pared fúngica es mucho más resistente que la membrana de una célula humana. Por este motivo se ha intentado diseñar el método
de extracción más eficaz para cada tipo de muestra y comparar su eficacia extractiva con algunos métodos ya existentes.
2.1. Extracción de ADN de células en suspensión (levaduras)
Para la extracción de ADN de células en suspensión, en este caso levaduras, se compararon tres protocolos (Materiales y Métodos 5.1.1): el protocolo 1, modificado a partir del método descrito por Okhravi y colaboradores (Okhravi et al, 1998), que omite el paso de digestión con la enzima zimolasa y el tratamiento con fenol; el protocolo 2 desarrollado y cedido amablemente por la empresa Oculab que también omite el paso de digestión con la enzima zimolasa; y el protocolo 3 desarrollado en nuestro laboratorio. El experimento detallado a continuación permitió seleccionar el método de extracción más eficiente y sensible y que además permitiera la amplificación del ADN aislado mediante PCR.
Se tomó un cultivo de C. famata de D.O a 600 nm de 0,6 y se realizaron dilucionesseriadas 1/10 del mismo, hasta llegar a una densidad celular de 5x102 células/ml (contaje realizado
mediante la placa de Neubahuer). Se tomaron las suspensiones de levadura con densidades celulares comprendidas entre 5x102-5x106 células/ml y se procedió al aislamiento del ADN
empleando los tres métodos de extracción. Posteriormente, se realizó una PCR simple del ADN aislado de cada una de las diluciones empleando los oligonucleótidos ITS.
Figura 18. Análisis comparativo de la eficiencia de extracción de ADN de los tres métodos ensayados para células en suspensión. Tras la realización de diluciones seriadas de un cultivo de
levadura, se extrajo el ADN de las diferentes diluciones empleando los tres protocolos. p1: protocolo 1, p2: protocolo 2 y p3: protocolo 3. A continuación se realizó amplificación mediante PCR empleando los oligonucleótidos ITS y las muestras se analizaron en geles de agarosa. M: marcador de peso molecular. c-: control negativo de PCR y c+: control positivo de PCR.
Como se puede observar en la figura 18, el protocolo 3mostró una eficiencia de extracción de ADN dos órdenes de magnitud mayor que los otros dos métodos de extracción, lográndose extraer, por tanto, con dicho protocolo, ADN de muestras 100 veces más diluidas.
2.2. Extracción de ADN de sangre
Para la extracción de ADN de muestras de sangre, algunos autores recomiendan el empleo de kits comerciales porque acorta la duración del procedimiento y el ADN que se obtiene es de alta calidad (Bretagne and Costa, 2005; Dixon et al, 1998; Maaroufi, 2004; Wahyuningsih et al, 2000). Entre ellos, el QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen) ha sido ampliamente utilizado y aplicado con éxito en muestras clínicas, no detectándose prácticamente pérdida en el rendimiento o en la calidad de la extracción del ADN (Flahaut et al, 1998; Hendolin et al, 2000; Lass-Florl et al, 2001; Loeffler et al, 1997; Loeffler et al, 2000; Maaroufi, 2004; Skladny et al, 1999; Van Burik et al, 1998). Por este motivo, para la extracción de ADN de muestras sanguíneas se decidió comparar el protocolo 8, o lo que es lo mismo, el kit QuiAamp DNA Mini Kit (Qiagen) y el protocolo 9, un método desarrollado en nuestro laboratorio basado en el método descrito por Kenneth H. Rand y colaboradores (Rand et al, 1994) (Materiales y Métodos 5.1.4).
Para comparar ambos métodos, se tomaron dos alícuotas de 1ml de sangre humana. Tras la extracción se realizó amplificación mediante PCR simple con la pareja de oligonucleótidos β-globina.
Figura 19. Análisis comparativo de la eficiencia de extracción de ADN humano de los dos métodos ensayados para muestras de sangre. Se extrajo el ADN de cada mililitro de sangre
empleando dos protocolos. (A) Kit QuiAamp DNA Mini Kit (Qiagen) y (B) desarrollado en nuestro laboratorio basado en el método descrito por Kenneth H. Rand y col. A continuación se realizó amplificación mediante PCR empleando los oligonucleótidos β-glob y las muestras se analizaron en geles de agarosa. c-ext1 y c-ext2: control de extracción a partir de H2O. M: marcador de peso molecular. c-: control negativo de PCR y c+: control positivo de PCR.
Ambos protocolos presentaron una eficiencia similar en la extracción de ADN de células sanguíneas (figura 19). Por tanto, el siguiente paso fue analizar la eficiencia de cada uno de los protocolos en la extracción de ADN genómico fúngico. Para ello, se preparó un cultivo de C. famata según se describe en Materiales y Métodos, se realizaron diluciones seriadas 1/10 y se extrajo el ADN de cada una de ellas con los dos protocolos descritos previamente. Finalmente se realizó PCR simple con los oligonucleótidos ITS.
Figura 20. Análisis comparativo de la eficiencia de extracción de ADN fúngico de los dos métodos ensayados para muestras de sangre. Tras la realización de diluciones seriadas de un
cultivo de levadura, se extrajo el ADN de las diferentes muestras empleando los dos protocolos. (A) Kit QuiAamp DNA Mini Kit (Qiagen) y (B) desarrollado en nuestro laboratorio basado en el método descrito por Kenneth H. Rand y col. A continuación se realizó amplificación mediante PCR empleando los oligonucleótidos ITS y las muestras se analizaron en geles de agarosa. 10-2-10-9: dilución correspondiente. YEPD: control de extracción a partir de YEPD. c-ext1 y c-ext2: control de extracción a partir de H2O. M: marcador de peso molecular. c-: control negativo de PCR y c+: control positivo de PCR.
El rendimiento de extracción de ADN del protocolo 9 (figura 20B) resultó ser diez veces superior al obtenido con el protocolo 8 (figura 20A) y por tanto es el que se utilizó en experimentos posteriores.