Un factor crítico para determinar la fidelidad y rendimiento de la técnica de PCR, lo constituye el grado y especificidad de hibridación de los oligonucleótidos a sus correspondientes secuencias diana. Este parámetro va a depender de la temperatura de hibridación y la concentración de ciertos iones, en concreto Mg2+. Un aspecto a tener en
cuenta es que cada pareja de oligonucleótidos requiere concentraciones iónicas y temperaturas diferentes en cada caso.
Por tanto, el primer objetivo de esta tesis doctoral fue buscar las condiciones de concentración de Cl2Mg y de temperatura de hibridación óptimas para cada una de las
parejas de oligonucleótidos empleadas en este trabajo y explicadas previamente. Estos ensayos de optimización se realizaron empleando como molde ADN extraído de linfocitos para los oligonucleótidos β-globina y ADN extraído de C. famata en el caso de los oligonucleótidos que hibridan en los genes que codifican para el ARN ribosomal de levadura (técnica de extracción de ADN detallada en Materiales y Métodos 5.1.1,
protocolo 3). Los parámetros de los oligonucleótidos Ikaros, habían sido previamente optimizados por el laboratorio del doctor Fernández Piqueras.
1.2.1. Concentración de Cl2Mg
La concentración óptima del ión Mg2+ en la reacción de PCR suele estar condicionada por
las posibles sales o quelantes que puedan estar disueltas en las preparaciones de ADN y/o por el exceso de nucleótidos. Este hecho hizo necesaria la búsqueda de las condiciones experimentales óptimas para cada caso concreto ADN-pareja de cebadores.
En primer lugar, se realizó una aproximación inicial usando un rango de concentración de Cl2Mg comprendido entre 4 mM y 20 mM (datos no mostrados). Esto permitió conocer el
intervalo de concentración en el que se amplificaba más cantidad de ADN molde con cada pareja de oligonucleótidos tal y como se muestra en la tabla 5. A continuación, se realizó una segunda aproximación empleando concentraciones de Cl2Mg comprendidas en dichos
intervalos, por ejemplo, 0,25 mM y 4 mM en el caso de los cebadores Leva 18s, consiguiendo así la concentración óptima.
Tabla 5. Intervalos de concentración y concentración optima de Cl2Mg para cada pareja de oligonucleótidos
Oligonucleótidos Intervalos de concentración de Cl
2Mg (mM) Concentración optima Cl2Mg (mM) Leva 18s 0,25-3,4 1,5 ITS 4-20 4-20 M18s 1-10 4-5 B-globina 0,5-5 1,5 Ikaros - 1,5 TaqMan 3-11 1,5
Los resultados muestran que la concentración óptima de Cl2Mg varía en función de la pareja
de oligonucleótidos utilizada en la reacción de PCR (tabla 5). Este es un dato importante, sobre todo en el caso de los oligonucleótidos ITS y los oligonucleótidos M18s puesto que se emplearán conjuntamente en experimentos posteriores (PCR anidada). Los valores óptimos de concentración de Cl2Mgse muestran en la tabla 5.
1.2.2. Temperatura de hibridación
La temperatura de hibridación de los oligonucleótidos depende de varios factores: • secuencia (en especial la relación de G y C),
• longitud
• posible presencia de desapareamientos con la secuencia complementaria en el molde.
En general, las temperaturas de hibridación predeterminadas (medidas por el factor de Tm) resultan adecuadas, aunque en ocasiones es necesario incrementar ligeramente dicha temperatura para evitar ciertos problemas como inespecificidades que generan secuencias de ADN distintas a las esperadas, problemas de estructura secundaria de los oligonucleótidos, etc. Por lo tanto, de la misma forma que en el caso del Cl2Mg, fue necesaria la búsqueda de
las condiciones experimentales óptimas de temperatura de hibridación para cada pareja de cebadores.
Para ello, se realizó una primera aproximación tomando el rango de temperatura comprendido entre 40ºC y 70ºC (datos no mostrados). Esto permitió conocer el intervalo de temperatura de hibridación en el que se amplificaba de forma específica más cantidad de ADN molde con cada pareja de oligonucleótidos (tabla 6). A continuación, se realizó una segunda aproximación empleando rangos de temperatura comprendidos en dichos intervalos, por ejemplo, 46ºC y 48ºC en el caso de los cebadores Leva 18s, consiguiendo así la temperatura de hibridación óptima en cada caso.
La temperatura de hibridación óptima de cada pareja de oligonucleótidos, como ocurre con la concentración de Cl2Mg, varía de unos a otros (tabla 6), aspecto que también se consideró posteriormente en los ensayos de PCR anidada.
Tabla 6. Intervalos de Tª y Tª óptima de hibridación para cada pareja de oligonucleótidos
Oligonucleótidos Intervalos de temperatura de
hibridación (ºC) Temperatura óptima (ºC)
Leva 18s 46-48 46,2 ITS 45-60 52 M18s 50-66 57,3 B-globina 50-70 60 Ikaros - 55 TaqMan 59-65 60
1.2.3. Polimerasas
Otro de los parámetros que influye en la sensibilidad de la amplificación mediante PCR es la ADN polimerasa Taq empleada. Por este motivo, se decidió comparar varias polimerasas suministradas por casas comerciales diferentes, para seleccionar aquella que aportara un mejor rendimiento y especificidad en la amplificación del ADN aislado. Las tres polimerasas empleadas fueron: la polimerasa de Perkin Elmer, la mezcla de reacción 2xJumpStart de Sigma (que contiene la polimerasa de Sigma) y la polimerasa de Bioroon. Para el estudio comparativo con cada una de las tres polimerasas, se tomó un cultivo de levadura de D.O a 600 nm de 0,6 y se realizaron diluciones seriadas 1/10 seleccionándose el intervalo de diluciones de 10-2
a 10-9. Se realizó extracción de ADN de cada una de las suspensiones obtenidas y a
continuación se procedió a hacer PCR simple con cada una de las polimerasas y los oligonucleótidos ITS (figura 14).
Figura 14. Análisis comparativo de la sensibilidad de tres ADN Taq polimerasas. (A) ADN
Taq polimerasa de Perkin Elmer, (B) ADN Taq polimerasa de Sigma y (C) ADN Taq polimerasa de Bioroon. 10-2-10-9: diluciones del cultivo de C. famata. YEPD: control de extracción a partir de YEPD. c-ext 1, c-ext 2 y c-ext 3: control de extracción a partir de H2O. M: Marcador de peso molecular, c-: control negativo de PCR y c+: control positivo de PCR. Se extrajo el ADN de cada muestra y se realizó PCR con cada una de las tres polimerasas. A continuación las muestras se analizaron en geles de agarosa.
En la figura 14 puede observarse que las polimerasas de las casas comerciales Perkin Elmer y Sigma (figura 14A y 14B respectivamente) eran capaces de amplificar el ADN molde presente en la dilución 10-3, mientras que la de Bioroon no era capaz de amplificar ADN de
polimerasa de Sigma amplificaba secuencias inespecíficas que dificultaban la interpretación de los resultados (datos no mostrados). Por ello se seleccionó la polimerasa de Pekin Elmer para ser empleada en ensayos posteriores.