Para comprobar si las proteínas MblA, MblB y MblC de Drosophila tienen la misma función, así como si el gen humano MBNL1 es el homólogo funcional del gen muscleblind, utilizamos el sistema GAL4/UAS.
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El sistema GAL4/UAS permite expresar un gen en Drosophila de una manera dirigida en el espacio y en el tiempo. Por un lado se genera una línea que contenga el gen que queremos expresar clonado aguas abajo de la secuencia UAS (upstream activation sequence) diana del factor de transcripción GAL4. Por otro lado tenemos una línea que expresa bajo la secuencia reguladora de un determinado gen el factor de transcripción GAL4. Al cruzar ambas líneas GAL4 se expresa en uno o unos determinados tejidos y se une a su secuencia diana UAS activando la expresión del gen de interés con ese patrón de expresión (Figura 2.1).
Figura 2.1. Esquema representativo de la expresión de un gen de interés mediante el sistema GAL4/UAS. La secuencia GAL4 codifica para un activador transcripcional de levadura que en la línea
representada fue fusionada con el promotor del gen daughterless de expresión ubicua. La construcción se introduce en el genoma de Drosophila con un elemento P artificial marcado con el gen miniwhite de
Drosophila. La línea que expresa la proteína GAL4 se cruza con líneas que llevan el gen de interés, en
este caso mblA, mblB mblC y MBNL1. Estos transgenes están subclonados aguas abajo de los cinco sitios de unión GAL4, los UAS (círculos). Estas construcciones también son introducidas dentro del genoma de Drosophila flanqueadas por las repeticiones invertidas del elemento transponible P llevando el marcador genético del gen miniwhite. En la progenie del cruce, la unión de GAL4 a UAS activa la transcripción del gen diana sólo en las células y tejidos donde se expresa el factor de transcripción GAL4.
En estos experimentos fue necesario disponer de cepas de moscas que contuvieran una construcción UAS-mblA, -mblB, -mblC y -MBNL1 en un fondo genético heterozigoto para la mutación muscleblind. Así como cepas que expresaran GAL4 con el patrón adecuado también en un fondo heterozigoto para la mutación mbl. Utilizamos dos líneas GAL4, una con la secuencia reguladora del gen Dmef2,
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expresándose en toda la musculatura embrionaria y otra línea GAL4 con el promotor del gen daughterless, de expresión general en el embrión.
Cruzamos las líneas UAS con las GAL4 generándose, entre otros, embriones mutantes mbl en los que se expresaba el gen humano MBNL1 o alguno de los tres transcritos de mbl de Drosophila en el sistema muscular o en todo el embrión según la línea GAL4 utilizada. Si ocurría rescate, una posibilidad era que los embriones mutantes llegaran a nacer como larvas de primer estadio. Para genotipar las larvas, las cepas UAS y GAL4 anteriores se sintetizaron en un fondo genético yellow y con la mutación mbl equilibrada con un cromosoma CyO y+, de manera que sólo las larvas
homozigotas para la mutación mbl (no tienen el cromosoma equilibrador marcado con y+) tenían las mandíbulas amarillas, a diferencia de las y+ que son pigmentadas
(Monferrer y Artero, 2006).
2.3.1. Generación de stock “UAS” para experimento de rescate
Disponíamos de cuatro líneas UAS-mblA, mblB, mblC y MBNL1 localizadas en el cromosoma 3 de Drosophila (Garcia-Casado et al., 2002).
PBB w; UAS-mblA/TM3 (Tz2) X y w; Gla/CyO y +
F1B ♂ y w; Gla/+; UAS-mblA/+ X ♀ y w; Gla/CyO y+
F2B y w; Gla / CyO y+; UAS-mblA/+
♀ y w; mblE27/CyO y+ X ♂ y w; Gla / CyO y+; UAS-mblA/+
F3 y w; mblE27/CyO y+; UAS-mblA/+
y w; mblE27/CyO y+; UAS-mblA
Por autocruzamiento se establece una línea UAS homozigota para el transgén y heterozigoto para mbl.
2.3.2. Generación de un stock “GAL4” para experimento de rescate
Partíamos de una línea con dos construcciones GAL4 diferentes aunque sólo una de ellas nos interesaba. El cromosoma 2 contenía twist-GAL4 y el cromosoma 3 Dmef2-
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GAL4, la de nuestro interés, todo ello en un fondo genético y1 w1118. Para el caso de la
expresión general en el embrión partíamos de un stock daughterless-GAL4 en el cromosoma 3 y en un fondo genético white1118.
PC y w; twi-GAL4; Dmef2-GAL4 X wgsp-1/CyO; Ki’/TM3ftzlacZ Sb
F1C
♂ y w; twi-GAL4/ wgsp-1; Dmef2-GAL4/ Ki’ X ♀ y w; Gla/CyO y+
F2C y w; wgsp-1/ CyO y+; Dmef2-GAL4/ +
♀ y w; mblE27/CyO y+ X ♂ y w; wgsp-1/ CyO y+; Dmef2-GAL4/ +
F3’ y w; mblE27/CyO y+; Dmef2-GAL4/ +
y w; mblE27/CyO y+; Dmef2-GAL4
Por autocruzamiento se establece una línea homozigota para GAL4 y heterozigota para mbl.
2.3.3. Cuantificación experimento de rescate
Para llevar a cabo el experimento de rescate cruzamos hembras vírgenes del stock GAL4 y machos del stock UAS llevando diferentes alelos muscleblind, mblE16 y mblE27
para que complementaran en el caso que contuvieran otra mutación letal en el cromosoma 2. Cruzamos aproximadamente 40 hembras vírgenes y 20 machos en un sistema de recogida de huevos a 25 ºC. Tras un periodo de habituación de 24 horas procedimos a un cambio de placa cada 20 h aproximadamente. Los huevos, de edad comprendida entre 0 y 20 h, los colocamos en una nueva placa en grupos de 5 para facilitar el recuento. Pasadas aproximadamente 24 h desde que una placa había sido puesta empezamos a contar las larvas de primer estadio nacidas clasificándolas como normales si poseían mandíbulas negras (fenotipo silvestre) o como rescatadas si poseían mandíbulas amarillas (fenotipo yellow). El número de larvas emergidas lo anotamos diariamente. Cada placa la observamos al menos 2 días y el experimento duró 7 días.
Los fenotipos que observamos en la descendencia los dividimos en tres clases: larvas heterozigotas con mandíbulas negras, larvas mutantes muscleblind rescatadas
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con mandíbulas amarillas y embriones que no eclosionaron, constituidos por huevos no fecundados u embriones homozigotos para el equilibrador o para la mutación muscleblind, en los cuales no se ha rescatado la letalidad.
Puesto que se espera en la descendencia dos terceras partes de las larvas heterozigotas para la mutación así como un tercio para las mutantes rescatadas si el rescate fuera completo, contabilizamos el grado de rescate como larvas heterozigotas para la mutación muscleblind. Así pues la mitad de las larvas heterozigotas contadas son las larvas mutantes rescatadas esperadas. Con este dato y contando el número de larvas rescatadas observadas calculamos el porcentaje de rescate.
Obtuvimos intervalos de confianza para todos los rescates y para comparar dos proporciones (grados de rescate) aplicamos el test estadístico exacto de Fisher. Ambos cálculos los hicimos a través de la página electrónica http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html.
En resumen, en estos experimentos generamos los siguientes genotipos relevantes;
y w; mblE16/ mblE27; UAS-mblA/ da-GAL4 y w; mblE16/ mblE27; UAS-mblB/ da-GAL4 y w; mblE16/ mblE27; UAS-mblC/ da-GAL4 y w; mblE16/ mblE27; UAS-mblC/ Dmef2-GAL4 y w; mblE16/ mblE27; UAS-MBNL1/ da-GAL4 y w; mblE16/ mblE27; UAS-MBNL1/ Dmef2-GAL4
El alelo letal mblE27 y mblE16 fue generado por escisión imprecisa de la inserción del elemento P l(2)k05507 y l(2)01038, respectivamente (Begemann et al., 1997; Artero et al., 1998).