Unadjusted model B Adjusted model 1 C Adjusted model

melanogaster

Dirigimos la expresión de las repeticiones CTG de modo general en la musculatura mediante el siguiente cruce:

P Mhc-GAL4 X y w; UAS-(CTG)480 1.1

F1 Mhc-GAL4/+; UAS-(CTG)480 1.1/+

2.6.1. Tejidos embebidos en parafina

Lavamos las moscas en PBS 1X durante 10 min, fijamos en paraformaldehído 4 % en PBS durante 30 min y lavamos en PBT (tritón X-100 0.3 %) durante 10 min, todo en agitación.

Deshidratamos las moscas con tres lavados de 1 h cada uno con etanol al 70 %, 96 % y 100 %. El lavado de 70 % se puede alargar durante toda la noche.

Lavamos en etanol absoluto dos veces para eliminar completamente el agua e hicimos un lavado de 7 min con tolueno. Eliminamos el tolueno y pusimos en parafina a 60 ºC durante toda la noche. Cambiamos la parafina y dejamos durante unas 3 h. Colocamos la muestra en el molde, en la orientación deseada y dejamos con parafina a temperatura ambiente hasta que se solidificara. Lo desmoldamos y en un microtomo hicimos unas primeras secciones a 10 μm, las colocamos en portaobjetos gelatinizados y con gotas de agua, les añadimos azul de toluidina y una vez secos a

Material y Métodos

40 ºC miramos al microscopio si estaban bien orientados. A las siguientes secciones no les añadimos azul de toluidina y las secamos a 40 ºC.

Desparafinamos los portaobjetos en baños de xilol durante 15 min, de etanol al 100 %, 96 % y 70 % y de agua durante 5 min cada uno.

Tinción con hematoxilina eosina

Teñimos con hematoxilina de Mayer durante 10-15 min. Tras un lavado en agua de 5 min los bañamos en eosina durante 5 min, los volvimos a lavar en agua durante 5 min y los deshidratamos en baños de etanol al 70 %, 96 % y 100 % durante 5 min cada uno. Finalmente pusimos los portaobjetos en un baño con xilol durante 10-15 min y los montamos en DPX.

Paraformaldehído: 4 % (peso/ vol) paraformaldehído (Sigma) en PBS (Roche). PBT1X-0.3 %: tritón X-100 (Roche) en PBS 1X (Roche).

Hematoxilina de Mayer: (Panreac).

Eosina amarillenta: 1 % (peso/vol) eosina (Panreac) en H2O.

DPX: (Fluka).

2.6.2. Tejidos embebidos en resina

Este protocolo lo realizamos siguiendo las instrucciones descritas en Tomlinson y Ready (1987). Mezclamos 2 ml de tampón 1 con 2 ml de tetraóxido de osmio. Dormimos las moscas y les cortamos la cabeza y parte del abdomen. Transferimos los tórax en un tubo eppendorf con 200 μl del tampón 1 en hielo. Añadimos 200 μl de tampón 1: tetraóxido de osmio (en campana) y dejamos 30 minutos en hielo. Eliminamos todo el líquido y añadimos 200 μl tampón 1: tetraóxido de osmio, los dejamos durante 1 ó 2 h en hielo. Eliminamos todo y deshidratamos con 500 μl de los alcoholes al 30 %, 50 % y 70 % durante 5 min cada uno en hielo y con los alcoholes 90 % y 100% durante 5 min a temperatura ambiente. Deshidratamos con óxido de propileno dos veces durante 10 min y añadimos el mismo volumen de óxido de propileno: resina dejándolo toda la noche. Eliminamos el óxido de propileno: resina y añadimos resina pura dejándolo al menos 4 h (en campana). Colocamos los tórax en los moldes orientándolos y rellenando los moldes con resina. Lo dejamos toda la noche a 70 ºC, desmoldamos y cortamos en secciones de 1.5 μm en un ultramicrotomo con cuchilla de diamante. Las secciones las colocamos en portas gelatinizados y las observamos al microscopio óptico.

Material y Métodos

Tampón 1: ¼ de glutaraldehído al 8 %, ¼ de H2O, ¼ de Na2HPO4 a 0.2 M (autoclavado) y ¼ de NaH2PO4

a 0.2 M (autoclavado).

Glutaraldehído 8%: (Fluka).

Tetraóxido de Osmio: (Polysciences Inc.)

Óxido de propileno: (Fluka)

Resina epoxi Durcupan blanda: mezclar resina (Fluka), endurecedor (Fluka), acelerador (Fluka), y plastificante (Fluka).

2.6.3. Tinción con anti-kettin en larvas de D. melanogaster

Colocamos una larva de tercer estadío sobre una placa de silicona, la lavamos con PBS y la secamos bien. La fijamos con un alfiler por cada extremo e hicimos un corte pequeño transversal con la tijera en el extremo posterior. A partir de este punto cortamos longitudinalmente haciendo “tienda de campaña”, para minimizar el daño tisular. Con un alfiler buscamos el borde del corte, abrimos la larva y fijamos el alfiler. Repetimos la maniobra hasta dejar la larva fijada con dos alfileres por cada lateral, lo más cerca posible de los extremos. Lavamos bien con PBS y la secamos. Cubrimos la larva con unas gotas de paraformaldehído al 4 % y la dejamos 1 h a 4 ºC. Paramos la fijación con PBT y con unas pinzas afiladas retiramos vísceras y traqueas hasta dejar el músculo lo más limpio posible. Lavamos 3 veces durante 5 min con PBT en agitación.

Tinción con anti-Kettin

Lavamos 2 veces con 100 μl/larva de solución de bloqueo durante 5 min y luego un lavado de 1 h a temperatura ambiente en agitación. Añadimos la solución de tinción de anticuerpo 1º a una dilución final 1/200 e incubamos a 4 ºC toda la noche en agitación suave o a temperatura ambiente durante 2 h. Lavamos 3 veces durante 15 min con 100 μl/larva de PBT en agitación y tubo horizontal y añadimos la solución de tinción de anticuerpo 2º a una dilución final de 1/200, incubamos 1 h a temperatura ambiente en agitación y tubo horizontal.

Retiramos el PBT de las larvas y añadimos la solución ABC (preparada 30 min antes) dejando en agitación 30 min a temperatura ambiente. Hicimos dos lavados de 10 min cada uno con PBS. Añadimos a las larvas el sustrato de la peroxidasa, la solución DAB e incubamos a 4 ºC durante 20 min, bajo la lupa añadimos 10 μl de H2O2 0,06 % y esperamos hasta que apareciera el color. Cuando estuvo bien teñida

Material y Métodos

paramos la reacción lavando con PBS 3 veces durante 5 min. Montamos en glicerol 80 % bajo un cubre elevado con tiras de celo. La observamos al microscopio óptico. Paraformaldehído: 4 % (peso/ vol) paraformaldehído (Sigma) en PBS (Roche).

PBT1X-0.3 %: 0.3% tritón X-100 (Roche) en PBS 1X (Roche).

Solución de Bloqueo: suero de cabra 5 % y BSA 2 % (peso/ vol) (Roche) en PBT1X-03 % (vol/vol).

Solución de tinción de anticuerpo primario (1/200): anticuerpo anti-Kettin en solución de bloqueo. Solución de tinción de anticuerpo secundario (1/200): anticuerpo anti-rata biotinilado en PBT1X-03 %. ABC: 10 μl de solución A (Avidina), 10 μl de B (Biotina) de Vectastain® _{Elite ABC kit (Vector Lab) en 1 ml}

de PBS 1X.

Solución DAB: 20 µl DAB en 400 µl de PBT 1X H2O2: 0.06 % H2O2 (Baker) en H2O

Glicerol: 80 % glicerol (Baker) en H2O

Alfileres de alambre: (ref: TGW0515). Pinzas finas: (Fine Science).

Silicona Rhodorsil: (VWR Internacional).