Discussion of Research Phases 2000-2001 We can now further develop the arguments put forward at the end of Research Phase

Los cebadores que se usaron en la validación por PCR y iPCR, se diseñaron usando la aplicación web Primer3Plus [Untergasser et al. 2007]. Se estableció una temperatura de fusión Tm de entre 58 ºC y 62 ºC y se determinó el tamaño máximo de los productos a amplificar en 4 Kb. El tamaño óptimo de los cebadores se estableció en 21 pb y el mínimo y máx imo en 1 9 y 2 6 pb respectivamente, aunque algunos cebadores sobrepasaron estos límites por la dificultad de su diseño en determinadas regiones del genoma. Se estableció la complementariedad máxima de su extremo 3’ en 2 bases, tanto consigo mismos como con su pareja, salvo en casos de difícil diseño en que se admitieron 3 bases. Se comprobó la ausencia de SNPs mediante el navegador genómico USCS [Kent et al. 2002], usando todas las capas de información disponibles sobre ellos provenientes de la base de datos dbSNP, tanto en el ensamblaje HG18 como en HG19. En el protocolo normal de la PCR se usaron parejas de cebadores flanqueando los puntos de rotura de las inversiones potenciales para determinar la orientación de la secuencia. En cada punto de rotura, cada una de las dos parejas de cebadores fue asociada a una de las orientaciones de la secuencia, para amplificar un fragmento de un tamaño diferente al de la otra pareja. De esta manera se pudieron diferenciar los productos por electroforesis en un gel de agarosa. Además se realizó una comprobación adicional para descartar la generación de productos inespecíficos en la PCR, una búsqueda de cuántos fragmentos se pueden amplificar en el genoma humano para cada pareja de cebadores. Debido a la repetitividad del genoma humano, se pueden amplificar fragmentos inespecíficos más pequeños o del mismo tamaño que el producto deseado, que pueden interferir en la PCR. Se comprobó mediante primer-BLAST que no se amplificasen fragmentos de este tipo [Ye et al. 2012]. Finalmente, siempre que fue posible, se diseñaron los cebadores externos, los que hibridan fuera de la región invertida, para que fueran compatibles con ambos cebadores internos, que son específicos de cada orientación en un punto de rotura. De esta manera y teniendo en cuenta que amplificasen fragmentos de distinto tamaño, se diseñaron para realizar una PCR multiplex, es decir, una PCR en la que se amplifican a la vez fragmentos de la orientación estándar y de la orientación invertida, siempre que el individuo sea heterocigoto para la inversión. Si no lo es, se amplifica solo el fragmento correspondiente al alelo presente (Figura 2.5). En este caso, se comprobó que los dos cebadores específicos de cada alelo no formaran una pareja que amplificase fragmentos que pudiesen interferir con el producto de la PCR debido a su tamaño y que permitiesen diferenciar los productos en la electroforesis. Además, siempre que no hubiera problemas de incompatibilidad, se usaron los cebadores internos para ambas orientaciones conjuntamente con el cebador externo del mismo punto de rotura.

Figura 2.5: Esquema del diseño experimental de PCR para validar inversiones cromosómicas. En la parte izquierda se muestra la orientación correspondiente al alelo estándar y en la parte derecha la del alelo invertido. El nombre de los cebadores coincide con el esquema

A-B-C-D de las secuencias alrededor de los puntos de rotura (PR) en la orientación estándar. Se diseñaron 3 cebadores para cada punto de rotura, uno común, de color negro, localizado fuera de la inversión, que es específico del punto de rotura; y dos específicos de cada orientación localizados dentro de la región invertida. Generalmente estos dos cebadores se pueden usar para ambos puntos de rotura, por ejemplo el cebador B de color azul es específico del alelo estándar para el primer punto de rotura y del alelo invertido para el segundo punto de rotura. Las dos parejas de cebadores implicados en cada punto de rotura se diseñaron para amplificar fragmentos de tamaño diferente de manera que los productos se pueden diferenciar en un gel de agarosa, por ejemplo A-B y A-C para el primer punto de rotura.

Las reacciones de PCR se prepararon en un volumen total de 25 μl, que contenía 1x buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.2 μM de cada dNTP, 0.4 μM de cada cebador, 1.5 U de Taq

polimerasa (BioTherm) y 50-100 ng de ADN genómico. En el caso de las PCR multiplex, se usó una concentración final de 0.8 μM para el cebador común compartido por los fragmentos específicos de uno y otro alelo, y de 0.4 μM para el resto. Cada reacción siguió el siguiente protocolo, en primer lugar un paso de desnaturalización de 5 minutos a 95 ºC, seguido de 30-35 ciclos a 95 ºC por 30 segundos, un paso de apareamiento de 59-62 ºC por 30 segundos, un paso de extensión por 20-120 segundos y un paso de extensión final de 7 minutos a 72 ºC. En las PCR de rango largo que amplifican productos d e 5 a 1 0 Kb, se usaron 100-200 ng de ADN genómico y 2.5 unidades de ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene). Las condiciones de reacción fueron 92 ºC por 2 minutos, 35 ciclos a 92 ºC por 10 segundos, 60-66 ºC por 30 segundos, 68 ºC por 10-15 minutos y 68 ºC por 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5-2% teñido con bromuro de etidio; para los productos de PCR más largos se usaron porcentajes de entre 0.8-1%. En el caso de las amplificaciones a partir de clones BAC, no se extrajo el ADN, se resuspendió una colonia del clon en 100 μl de TE (con una proporción 10:0.1 de Tris:EDTA) y se usaron 2 μl como molde. En la PCR inversa, el ADN genómico se cortó con enzimas de restricción que generan extremos cohesivos. Las enzimas que se usaron tienen dianas de restricción dentro y fuera de la región invertida, pero no en los puntos de rotura. Se muestran en la Tabla 2.1.

Tabla 2.1: Enzimas de restricción usadas en el protocolo de PCR inversa.

De manera general se digirieron 150 ng de ADN genómico durante toda la noche a 37 ºC, usando 3 unidades de enzima de restricción. Después se inactivó la enzima de restricción mediante la incubación a alta temperatura (temperatura de inactivación por calor específica de cada enzima). Posteriormente se circularizó el ADN digerido, mediante una reacción de ligación a 25 ºC durante 3 horas. Las proporciones usadas en las reacciones de ligación fueron 1x buffer y 400 unidades de ligasa de ADN T4 (New England Biolabs) en un volumen total de 175 μl. Se inactivó por calor la enzima ligasa durante 10 minutos a 65 ºC y finalmente se usaron 10 μlde producto de ligación (aproximadamente 8.6 ng de ADN ligado) como molde en la reacción de PCR. Los cebadores amplificaron alrededor de los sitios de restricción y ligación. En el caso concreto de la inversión HsInv0090 se llevó a cabo una digestión parcial con la enzima NsiI. Se digirió el ADN durante 40 minutos después de probar diferentes tiempos de digestión entre 10 minutos y 3 horas. La digestión parcial permite usar enzimas de restricción que tienen dianas en los puntos de rotura, ya que no se digiere totalmente el ADN, de manera que se generan los fragmentos deseados, en los que la enzima ha cortado dentro y fuera de la inversión pero no en el punto de rotura.

En la validación por PCR y iPCR, se seleccionaron las inversiones potencialmente polimórficas según su soporte por PEM, que tuviesen tamaños mayores o iguales a 1 Kb o que pudiesen tener efectos posicionales de sus puntos de rotura sobre genes. La validación consistió en la genotipación de 10 individuos, 9 individuos de distintas poblaciones humanas (anteriormente nombrados) [Kidd et al. 2008], y J. Craig Venter. Una inversión fue validada como polimórfica en el genoma humano cuando se encontraron ambos alelos entre los cromosomas de los 10 individuos. En ese caso, fueron

genotipadas experimentalmente del mismo modo en 90 individuos Europeos. En caso de amplificar solo alelos invertidos, se genotipó el BAC correspondiente a la región en el genoma de Referencia para analizar la posible existencia de un error en el ensamblaje. En el caso de amplificar solo alelos estándar en HuRef, se comprobó su secuencia mediante la secuenciación de los fragmentos amplificados y el alineamiento con el genoma de Referencia.

2.5. Secuenciación

En aquellas situaciones en que fue necesario analizar si el producto amplificado en la PCR correspondía con el producto esperado, se secuenció la banda separada en la electroforesis. Es el caso de los errores en HuRef, regiones donde la muestra de ADN de J. Craig Venter amplificó productos correspondientes a la orientación estándar (Figura 2.6).

Figura 2.6: Alineamiento de los fragmentos secuenciados con el genoma de Referencia. Se muestra la secuencia del genoma de Referencia HG18 representada por una línea negra, donde se han anotado los cebadores y las RIs, con un 86% de identidad, de color amarillo. En este ejemplo la secuencia amplificada a partir de HuRef tiene la misma orientación que el genoma de Referencia. Se trata del error en HuRefHsInv0078. Los fragmentos se amplificaron a partir de los cebadores que se muestran en la parte superior de la muestra de ADN de J. Craig Venter. Se muestran en verde los fragmentos amplificados a partir de cebadores directos, como A1 y C1, y en rojo los fragmentos de cebadores reversos, B1 y D1. En negro debajo de la secuencia del genoma de Referencia se muestra la secuencia consenso formada por las secuencias de los fragmentos amplificados, que alinea perfectamente con el de Referencia.

En primer lugar se separaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajo el ADN mediante el kit Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Los productos de PCR se secuenciaron mediante el método Sanger por la empresa Macrogen en Seoul, Korea. Los fragmentos secuenciados se alinearon con el genoma de referencia para comprobar si se trataba de la misma secuencia. Para ello se usó el programa CLC Main Workbench 7.0.3 [http://www.clcbio.com].