6.1. INSTRUMENTAL
• Cabina de seguridad biológica clase II.
• Estufa de cultivo de CO2 y 37ºC (control diario de
temperatura).
• Microscopio invertido, dotado de objetivos de 10X, 20X y 40X.
• Cámara hematocimétrica.
• Microcentrífuga para tubos de fondo cónico (tipo Eppendorf) y rotor angular, con velocidad de rotación mínima de 5.000 rpm (p.ej., la Haraeus Biofuge 13 o similar).
• Agitador orbital tipo vortex.
• Secador de aire convencional para cabello.
•Microscopio de fluorescencia con filtro para isotiacionato de fluoresceína, provisto de objetivos de 20X y 40X.
6.2. MATERIALES
• Pipetas de bulbo estériles.
• Jeringas y filtros de 0,22 µm.
•Tubos de cultivo celular estériles (varios proveedores) de 15 ml
•Portas de fluorescencia con varios pocillos. Alternativamente, podrían utilizarse portas convencionales, con pocillos marcados con un rotulador de laca o lápiz de cera.
• Recipientes para lavado de los portaobjetos.
• Cámara húmeda.
6.3. INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD
• Deben seguirse las normas básicas de protección frente a patógenos de transmisión parenteral o respiratoria establecidas en el “Manual de bioseguridad”.
7. PROCESAMIENTO
7.1. CULTIVOS CELULARES: PREPARACIÓN DE TUBOS
• Tripsinizar las células, añadiendo 2-3 ml de solución de tripsina-EDTA en el frasco Falcon que contiene la monocapa de cultivo celular.
Fecha:
PNT-VIR-01 Servicio de Microbiología
Hospital... simple en cultivo convencional en tuboAislamiento de los virus del herpes
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•Cuando las células empiecen a picnotizarse y despegarse (controlar mediante el microcopio invertido), parar la tripsinización añadiendo 5-10 ml de MEM con 10% de suero bovino fetal.
• Mediante una pipeta y un bulbo de goma, aspirar y expulsar el medio, haciendo que el líquido golpee la superficie del cultivo, con el fin de despegar las células y lograr una suspensión homogénea. Evitar, en la medida de lo posible, la formación de espuma.
•Contar las células viables en cámara hematocimétrica con azul tripán (son viables las que no permiten la entrada del colorante azul).
•Ajustar la suspensión a 100.000 células/ml, añadiendo medio de crecimiento (MEM+10% suero bovino fetal+solución de antibióticos; ver “Manual de preparación de medios y reactivos”).
• Repartir en los tubos de cultivo celular, a razón de 1,5-2 ml.
•Colocar los tubos en la estufa de CO2, con los
tapones sin cerrar completamente, y con una inclinación aproximada de 5 grados.
•Incubar hasta que se forme una monocapa confluente en la parte inferior de los tubos.
7.2. INOCULACIÓN DE LOS TUBOS
• Rotular el número de orden de la muestra y la fecha en el tubo (por el lado opuesto a la monocapa).
• Retirar el medio de crecimiento en el que están bañadas las células (volcando).
• Añadir 4 gotas de la muestra (0,2 ml) con pipeta de bulbo.
• Incubar a 37ºC durante 1 hora (con un ángulo de inclinación de 5º).
• Pasado este tiempo, retirar la muestra (volcando).
•Añadir 1,5 ml de medio de mantenimiento (MEM+2% suero bovino fetal + solución antibiótica).
• Incubar a 37ºC y atmósfera del 5% de CO2
• Al día siguiente, después de visualizar los tubos al microscopio invertido para ver si la monocapa están bien formada y no hay contaminación, cambiar nuevamente el medio de mantenimiento, retirando el anterior volcando el tubo, y añadir 1,5 ml de medio de mantenimiento nuevo.
7.3. MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS CONVENCIONALES
•Los tubos se observan periódicamente al microscopio invertido (Vero y MRC-5), para detectar el efecto citopático característico de los virus del herpes simple (monocapa con células redondeadas refringentes que rompen la capa y progresan con rapidez; Anexo 1), en cuyo caso se procede a la realización de un subcultivo y raspado de la monocapa para realizar una inmunofluorescencia de identificación .
• Si a los 15 días no aparece el efecto citopático, informar como cultivo negativo.
7.4. SUBCULTIVO O PASES
• Se realizan raspando levemente la capa celular (con la punta de una pipeta tipo Pasteur, o con el raspador que se utiliza para la técnica de inmunofluorescencia) y tomando 0,2 ml (4-5 gotas) para transferirlas a un tubo nuevo, en el que previamente se ha añadido medio de mantenimiento.
• El nuevo tubo se rotula poniendo el número de muestra, los códigos de tipo celular y el número de pase y la fecha de subcultivo.
7.5. IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE LOS CULTIVOS POR TINCIÓN DE INMUNOFLUORESCENCIA
Esta técnica, que aquí se utiliza para confirmar un efecto citopático sugestivo de VHS, y para tipificar, puede servir como base para la detección directa de antígenos víricos a partir de las muestras de vesículas (ver PNT-VIR-03), o para teñir los cultivos rápidos en shell-vial (ver PNT-VIR-04), con las correspondientes variantes técnicas.
Preparación de los portaobjetos a partir de los cultivos
•Despegar mecánicamente el cultivo, raspando suavemente la parte del tubo con monocapa celular.
• Añadir PBS estéril hasta la mitad del tubo.
• Centrifugar 5 minutos a 2.500 rpm.
• Retirar el PBS.
• Resuspender el sedimento agitando el tubo con el líquido restante, con agitador tipo vortex.
• Rotular los portas de inmunofluorescencia con el número de muestra, tipo de virus investigado (si se pretende realizar una tipificación del cultivo sospechoso), posición de muestras y controles (ver más adelante, “9. Control de calidad”).
• Poner 10-20 µl en los pocillos correspondientes y dejar secar (puede facilitarse mediante un secador con calor suave, calentador de preparaciones, estufa a 37 ºC, etc.).
Fijación de los portas
• Sumergir los portas en un recipiente tipo Köplin con solución FS, a 4 ºC.
• Mantener los portas durante 10 minutos.
• Pasar las preparaciones a un nuevo recipiente con solución SSN, a 4 ºC.
• Mantener sumergidos los portas durante 5 minutos.
• Sacar del recipiente, dejar escurrir y secar ligeramente las preparaciones.
Tinción de inmunofluorescencia
• Añadir 10-15 µl de cada anticuerpo monoclonal (según planilla) dejando un pocillo como control de la gammaglobulina donde se añade un control negativo.
•Incubar los portaobjetos a 37ºC durante 15-30 minutos en cámara húmeda.
• Lavar con PBS y agitación 10 minutos dos veces y después lavar en agua destilada unos segundos, dejar secar a temperatura ambiente.
Fecha:
PNT-VIR-01 Servicio de Microbiología
Hospital... simple en cultivo convencional en tuboAislamiento de los virus del herpes
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• Si se sigue una técnica de IF directa:
• Añadir una gota de líquido de montaje.
• Proceder a la observación de las preparaciones en el microscopio de fluorescencia.
• Si se sigue una técnica de IF indirecta:
• Añadir 10-20 µl de gammaglobulina anti-ratón marcada con fluoresceína e incubar a 37º durante 30 minutos en cámara húmeda.
• Realizar nuevamente 2 lavados de 1-2 minutos con PBS.
• Enjuagar en agua y secar al aire.
• Añadir líquido de montaje y observar a 400x en un microscopio de epiluminiscencia.
Lectura e interpretación
• Se valorará la presencia de fluorescencia en cada pocillo de las muestras y controles.
• Se considerará positiva la presencia de fluorescencia de color verde manzana, típica del isotiocianato de fluoresceína, localizada en el citoplasma celular.
• También deben observarse células fluorescentes en los pocillos de control positivo correspondientes, así como su ausencia en el control negativo (ver “9. Control de calidad”). Si no es así, la técnica no es válida.