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01 Edición inicial

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital ... La información en él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

Fecha:

PNT-VIR-03 Servicio de Microbiología

Hospital...

Detección directa del virus varicela- zóster en lesiones cutáneas mediante

inmunofluorescencia indirecta _{Edición Nº 01 Página 2 de 4}

1. PROPÓSITO Y ALCANCE

El objetivo de este documento es describir el proceso para detectar la presencia de antígenos del virus varicela-zoster (VVZ) en muestras clínicas procedentes de lesiones cutáneas, mediante una tinción de inmunfluorescencia indirecta (IFI).

Este procedimiento se aplica en el laboratorio de Virología del Servicio de Microbiología de este Hospital.

2. FUNDAMENTO

La infección de las células por el VVZ lleva consigo la expresión de ciertos antígenos propios del virus en diferentes localizaciones celulares que pueden detectarse con el empleo de anticuerpos monoclonales específicos y una técnica de IFI. 3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

• Procedimiento de recogida y procesamiento de muestras.

• Manual de preparación de medios y reactivos.

• Normas de bioseguridad.

• Gestión de residuos. 4. TOMA DE LA MUESTRA

Las condiciones de toma de la muestra están descritas en el “Procedimiento de recogida y procesamiento de muestras”. Esta técnica se aplica básicamente al diagnóstico del VVZ en muestras de origen cutáneo, en las que se tiene una mayor experiencia. Alternativamente, podría aplicarse a cualquier otra muestra biológica con contenido celular. La eficiencia de la técnica está condicionada a una buena obtención de la muestra, esto es, a que contenga un componente celular mínimo.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

•Tampón fosfato salino pH=7,2 (PBS), de procedencia comercial, según el suministrador habitual (concursos de suministros).

• Acetona, calidad reactivo.

• Anticuerpo monoclonal murino anti-VVZ (diferentes marcas). Está dirigido frente a una glucoproteína de la membrana.

• Conjugado anti-ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína, de procedencia comercial. Sirve el que se incluye en otros sistemas comerciales (kits) de técnicas de IFI.

6. APARATOS, MATERIAL E INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD

6.1. INSTRUMENTAL

• Microcentrífuga para tubos de fondo cónico (tipo Eppendorf) y rotor angular, con velocidad de rotación mínima de 5.000 rpm (p.ej., Heraeus Biofuge 13 o similar).

• Agitador orbital tipo vortex.

• Secador de aire convencional para cabello.

•Microscopio de fluorescencia con filtro para isotiacionato de fluoresceína, provisto de objetivos de 20X y 40X.

6.2. MATERIALES

• Hisopo (torunda) y medio de transporte para virus (MTV). Suele utilizarse un equipo comercial específico. Alternativamente, puede utilizarse un hisopo convencional y un tubo con medio de transporte y descontaminación de muestras para virus, preparado por el propio laboratorio.

• Pipetas Pasteur.

• Tubo de plástico de fondo cónico tipo Eppendorf de 1,5 ml.

•Porta de fluorescencia con varios pocillos. Alternativamente, podrían utilizarse portas convencionales, con pocillos marcados con un rotulador de laca o lápiz de cera.

• Recipientes para lavado de los portaobjetos.

• Cámara húmeda.

6.3. INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD

• Deben seguirse las normas básicas de protección frente a patógenos de transmisión sanguínea establecidas en el “Manual de bioseguridad”. 7. PROCESAMIENTO

7.1. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ORIGEN CUTÁNEO

• Se lleva a cabo con un hisopo de Dacron o de alginato y mango de plástico o aluminio, preferiblemente. Si la muestra no se va a utilizar también para cultivo de virus, sirve un hisopo convencional de algodón y mango de madera.

• Conviene insistir en que la toma de muestras debe hacerse raspando el material de la base de la lesión. Si hay vesículas, romper con una aguja la epidermis de estas, absorber el líquido con una torunda previamente y realizar el frotis a continuación. Cortar con tijeras el mango de la torunda, introducir en un tubo con MTV y cerrar bien.

7.2. PROCESAMIENTO PREVIO

• Agitar el tubo de MTV en un vórtex para liberar las células atrapadas en el material del hisopo.

• Con una pipeta Pasteur, pasar alrededor de 1,5 ml del MTV a un tubo de fondo cónico y centrifugar a una velocidad mínima de 5.000 rpm.

• Una vez centrifugado, eliminar el sobrenadante sobre recipiente con lejía dejando un pequeño volumen de líquido (alrededor de 50 µl) que se utilizará para resuspender el sedimento con ayuda de una pipeta Pasteur.

7.3. FIJACIÓN DE LAS MUESTRAS

• Colocar una gota del sedimento bien resuspendido (aproximadamente 25-30 µl) en un porta con pocillos para fluorescencia. La prueba se hace por

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duplicado. Puede utilizarse un porta para varias muestras, si fuese preciso.

• Rotular el número de muestra en el porta, anotando los pocillos que corresponden a cada muestra.

•Dejar secar al aire o en el secador de preparaciones.

• Fijar el porta sumergiéndolo en acetona fría (-20ºC, congelador de un frigorífico) durante 10 minutos. Una vez transcurridos, secar al aire.

•Los portas fijados pueden conservarse en congelador a una temperatura de -70ºC o inferior durante 7 días.

7.4. TINCIÓN DE LAS MUESTRAS

•Colocar una gota (20 µl son suficientes) del anticuerpo monoclonal anti-VVZ correspondiente sobre el pocillo con la muestra fijada.

• Incubar en cámara húmeda a 37±2ºC durante 25- 30 minutos.

• Lavar el porta sumergiéndolo en PBS dos veces.

• Dejar secar al aire o con ayuda de un secador, en frío.

• Añadir 20 µl de conjugado de cabra anti-ratón, el mismo que se utiliza en otras técnicas de IFI.

• Incubar durante 25-30 minutos en cámara húmeda, a 37±2 ºC.

• Lavar dos veces (3-5 minutos) en PBS. 7.5. LECTURA E INTERPRETACIÓN

•Colocar una gota de líquido de montaje para fluorescencia (glicerina tamponada) y un cubre encima, y proceder a la lectura en el microscopio de fluorescencia. Puede hacerse un barrido con objetivo 20X y confirmar a mayor aumento en caso de duda.

• En caso de positividad, el reactivo monoclonal proporciona una fluorescencia de membrana, apreciándose el citoplasma celular contrastado en rojo (azul de Evans) rodeado de un reborde fluorescente verde manzana (ver ANEXO 1).

• La muestra se considerará positiva sólo cuando se aprecien, al menos, 3 células características entre los dos pocillos de la preparación.

• Las células que no expresan el antígeno vírico presentan una coloración roja uniforme.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

• Si se aprecia el mínimo de 3 células características, la prueba es positiva: expresarla como “Positiva”.

• En caso contrario, expresarla como “Negativa”.

• Cuando no se observen más de 10 células teñidas de rojo (contratinción con el azul de Evans), la prueba debe informarse como “Indeterminada” o “No valorable”.

9. RESPONSABILIDADES Básicamente serán las siguientes:

• Área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras. Rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

•Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo; realización de la técnica; lectura de las preparaciones. Registro de resultados. Archivo de hojas de trabajo.

• Facultativo responsable: Supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, interconsultas, adopción de medidas correctoras de errores cometidos, firma de informes de resultados. 10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

• La detección directa de antígenos del VVZ se considera la prueba diagnóstica de referencia, pero su fiabilidad está condicionada a la obtención de una muestra de calidad.

• Los mejores resultados se obtienen sobre lesiones vesiculosas, recientes. Es recomendable tomar muestras de varias de estas lesiones.

• Habitualmente no se incluyen controles positivos ni negativos, ya que esto implicaría mantener cultivos con VVZ; si bien, su utilización cubriría la eventualidad de un fallo en la tinción o de una alteración del anticuerpo monoclonal.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

• Como se ha repetido, la calidad del resultado depende en gran medida de la presencia de celularidad en la preparación, esto es, de la calidad de la muestra.

• Es posible obtener resultados positivos a partir de lesiones evolucionadas (en fase de costra), pero la sensibilidad es menor (pero claramente superior al cultivo celular).

• Del mismo modo, el tratamiento antivírico (aciclovir o derivados) interfiere con los resultados, en tanto que mejoran las lesiones. Sin embargo, en estas circunstancias, la única posibilidad diagnóstica es la detección de antígeno, pues el cultivo es uniformemente negativo.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Geshon AA, LaRussa P, Steinberg SP. Varicella-zoster virus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology (8ª ed). Washington: ASM Press 2003; pp. 1319-1330.

2. Pérez JL, García A, Niubò J, Salvà J, Podzamczer D, Martín R. Comparison of techniques and evaluation of three commercial monoclonal antibodies for laboratory diagnosis of varicella-zoster mucucutaneous infections. J Clin Microbiol 1994; 32:1610-1613.

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13. ANEXOS