Hardware Implementation of Equal Area Distribution Algorithm

PNT-VIR-06

PRUEBA DE LA AVIDEZ IgG ANTI-VCA DEL VIRUS DE EPSTEIN-BARR

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

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01 Edición inicial

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital ... La información en él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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Prueba de la avidez IgG anti- VCA del virus de Epstein-Barr

Edición Nº 01 Página 2 de 3 1. PROPÓSITO Y ALCANCE

El objetivo de esta técnica es determinar el índice de avidez de los anticuerpos IgG anti-VCA (complejo antigénico de la cápside vírica) del virus de Epstein- Barr (VEB).

La prueba se lleva a cabo con suero obtenido de forma convencional, remitido al laboratorio de serología del Servicio de Microbiología de este hospital junto a un volante de petición en que se solicite la prueba mencionada.

2. FUNDAMENTO

El diagnóstico de la primoinfección sintomática (mononucleosis infecciosa) por el VEB se lleva a cabo mediante procedimientos serológicos (determinación de anticuerpos heterófilos y de anticuerpos específicos frente a distintos complejos antigénicos del VEB); ocasionalmente estos métodos no permiten alcanzar un diagnóstico incontrovertible de la enfermedad. El conocimiento del índice de avidez (IA) de las IgG anti-VCA permite inferir el tiempo de evolución de la infección y, en consecuencia, ayuda a establecer el diagnóstico de primoinfección. El procedimiento aludido se basa en lo siguiente: (i) durante la respuesta inmunológica primaria frente a un agente infeccioso cualquiera se generan IgGs cuya avidez (fuerza con que se unen a un antígeno) aumenta a medida que aquélla madura; (ii) los inmunocomplejos formados por un antígeno e IgGs de baja avidez se desunen con facilidad en presencia de agentes caotrópicos (urea). El IA suele determinarse mediante ELISA, aunque puede obtenerse también mediante inmunofluorescencia (IF). En ambos casos el suero del enfermo se incuba en duplicado con el antígeno elegido; después de lavar, se añade a una de las reacciones una solución de urea 6-8 M (a la otra, suero fisiológico). Finalmente se compara la “reactividad” del suero problema tratado y sin tratar con urea.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

• Procedimiento de recogida y procesamiento de muestras

• Normas de bioseguridad

• Gestión de residuos

4. TOMA DE LA MUESTRA

Las condiciones de la muestra están descritas en el procedimiento de “Recogida y procesamiento de muestras”. La prueba se lleva acabo sobre muestra de suero. Se requieren 10 ml de sangre.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

Para la preparación de reactivos propios del laboratorio deben seguirse las instrucciones específicas de preparación, control, conservación, etc., consignadas en el documento “Manual de preparación de medios y reactivos”.

• Kit ELISA comercial (anticuerpos IgG anti-VCA del VEB)

• Solución de urea 8 M en tampón fosfato salino (PBS) –pH=7,2-.

6. APARATOS, MATERIAL E INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD

6.1. INSTRUMENTAL

• Centrífuga de tubos convencional.

• Espectrofotómetro convencional 6.2. MATERIALES

• Estufa de 37 ºC

• Puntas de micropieta estériles

• Micropipetas calibradas

6.3. INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD

• Deben seguirse las normas básicas de protección frente a patógenos de transmisión sanguínea establecidas en el documento “Manual de bioseguridad”.

7. PROCESAMIENTO 7.1 PROCEDIMIENTO

Se emplea un kit ELISA comercial (IgG anti-VCA), por tanto han de seguirse escrupulosamente las instrucciones del fabricante.

•Diluir convenientemente el suero problema y dispensar el volumen requerido en duplicado. Añadir los controles positivos y negativos proporcionados por el fabricante así como un suero control de baja avidez IgG anti-VCA y otro de alta avidez previamente caracterizados.

• Incubar a 37ºC el tiempo recomendado por el fabricante

•Lavar 3 veces con el tampón de lavado suministrado en el kit.

• Añadir a uno de los dos pocillos problema 200 µl de una solución 8 M de urea en PBS e incubar durante 5 minutos a 37ºC. Añadir al otro pocillo 200 µl de PBS (en vez de PBS con urea).

• Lavar 3 veces con tampón de lavado.

• Añadir el conjugado e incubar el tiempo requerido.

• Lavar como se indicó anteriormente.

•Añadir el sustrato e incubar a temperatura ambiente en lugar oscuro durante 30 minutos.

• Añadir la solución de parada.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

• Leer las absorbancias en espectrofotómetro (450 nm).

• El IA se calcula del siguiente modo:

IA=Absorbancia suero problema con urea/Absorbancia suero problema sin ureaX100.

• La interpretación es la siguiente:

• IA=<50%: infección reciente. Apoya el diagnóstico de primoinfección.

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• IA=>80%: infección pasada, primoinfección poco probable.

9. RESPONSABILIDADES Básicamente serán las siguientes:

• Área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras. Rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

•Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo; realización de la técnica; lectura de las preparaciones. Registro de resultados. Archivo de hojas de trabajo.

• Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, interconsultas, adopción de medidas correctoras de errores cometidos, firma de informes de resultados. 10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

No procede.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

• La información obtenida mediante la prueba de la avidez IgG anti-VCA complementa la conseguida mediante los métodos serológicos clásicos (anticuerpos heterófilos y anticuerpos IgG e IgM anti-VCA e IgG anti-EBNA1); esta prueba no debe efectuarse, por tanto, de forma aislada.

• La cinética de maduración de la respuesta humoral primaria varía individualmente, lo que condiciona el valor absoluto de la prueba.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Andersson A, Vetter V, Kreutzer L, Bauer G. Avidities of IgG against viral capsid antigen or early antigen: useful markers for significant Epstein-Barr virus serology. J Med Virol 1994; 43:238-244.

2. Gray JJ. Avidity of EBV VCA-specific IgG antibodies. Distinction between recent prymary infection, past and reactivation. J Virol Methods 1995;52:95-104.

3. Robertson P, Beynon S, Whybin R, Brennan C, Vollmer- Conna U, Hickie I, Lloyd A. Measurement of EBV-IgG anti- VCA avidity aids the early and reliable diagnosis of primary EBV infection. J Med Virol 2003; 70:617-23.

4. Shubert J, Zens W, Weissbrich B. Comparative evaluation of the use of immunoblots and of IgG avidity assays as confirmatory tests for the diagnosis of acute EBV infections. J Clin Virol 1998; 11:161-172.

PNT-VIR-07

DETECCIÓN DE ADN DE VIRUS DE LA FAMILIA HERPESVIRIDAE EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)