En los estudios modernos de farmacocinética poblacional se enfoca a un sector de la población (por ej. la población pediátrica), en lugar de la evaluación de cada individuo en particular [43, 44]. Esto permite obtener conclusiones de parámetros poblacionales promedio, con una mejor idea de cómo se comporta el medicamento a gran escala. Estos estudios requieren un número pequeño de muestras por cada individuo, pero de un número más elevado de participantes. La limitada intervención al individuo, hace que los estudios poblacionales sean el diseño ideal, y en algunos casos, el único posible para la investigación farmacológica en niños [45]. Este diseño ha sido recomendado como el método estándar para los estudios de farmacocinética en la población pediátrica.
García-Bournissen y col. han publicado el primer estudio de farmacocinética poblacional aplicando un modelo al fenómeno de pasaje de medicamentos a la leche materna, tratándose en este caso de NFX [46]. Se utilizó una estrategia de análisis de datos pre-existentes de pacientes adultos combinado con modelos de farmacocinética poblacional y simulación para demostrar que la probabilidad de exposición significativa a través de la leche materna al NFX es limitada, por lo que la suspensión de la lactancia en una madre tratada con el fármaco no debería ser considerada obligatoria, en base a la información disponible. Sin embargo, es necesario estudiar más en detalle la transferencia (o ausencia de la misma) de NFX a la leche materna para poder realizar esta recomendación de manera universal. En particular, se necesita poner a punto las técnicas para el dosaje de NFX en leche, una matriz que presenta una particular dificultad desde el punto de vista analítico. Este paso está contemplado dentro de los objetivos de la presente propuesta, así como la extensión de la metodología al estudio del BNZ.
Dentro de las posibles técnicas aplicables a la cuantificación de BNZ, NFX y sus metabolitos, la cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) es la mejor aceptada, y considerada la metodología
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de referencia. Sin embargo, los protocolos disponibles en la literatura sólo contemplan la detección y cuantificación de las drogas madres, sin incluir sus respectivos metabolitos [47–49]. Por otro lado, no se ha desarrollado una cantidad suficiente de metodologías analíticas y pre-analíticas para ser utilizadas en diferentes matrices biológicas (sangre, plasma, etc.), encontrándose en la literatura escasos estudios para matrices no tradicionales (por ej. leche materna, muestras de tejidos, pelo, etc.) ó métodos de muestreo adecuados para el estudio poblacional o de metabolitos.
Existen varios trabajos publicados sobre determinaciones analíticas de BNZ. Raaflaub y Ziegler investigaron la biodisponibilidad del compuesto en plasma mediante polarografía diferencial de pulsos, los autores obtuvieron recuperaciones porcentuales de 78% y una reproducibilidad de 3,5% [50]. Walton y Workman determinaron BNZ y sus derivados de amina metabolizada en plasma humano mediante HPLC-UV con una R%= 90% y un reproducibilidad de 3,2% [51]. Barbeira y colaboradores han cuantificado BNZ por polarografía diferencial de pulsos en formulaciones farmacéuticas, obteniendo LD= 4 x10-7 mol L-1 y un RSD (%)= 2% (comparado con el valor suministrado por el fabricante) [52].
LaScalea y col. investigaron el comportamiento voltamperométrico de BNZ con un electrodo de carbono vítreo y un biosensor de ADN [53]. Este último permitió el estudio de las interacciones BNZ–DNA mediante el uso de ADN inmovilizado en la superficie del electrodo. Algunos autores han desarrollado métodos cromatográficos para cuantificar BNZ en plasma u orina con el objetivo de estudiar la farmacocinética en humanos [50, 54–57]. Guerrero y col. han determinado BNZ en plasma a partir de un método simple que consiste en la precipitación de las proteinas con ácido tricloroacético, obteniendo una R%= 94,6% con LD y LQde 0,8 y 1,6 g mδ-1, respectivamente y RSD (%) intra-interdía de 1,1 y 3,9%,
respectivamente.
Se han publicado algunos métodos para la determinación de ζFX en fluidos biológicos,
incluyendo cromatografía en capa fina (TLC) con detección óptica [58] y HPLC-UV [54, 49]. Los resultados obtenidos por TLC de ensayos en suero, plasma y orina tras la administración oral de NFX en ratas, perros y seres humanos permitió una determinación cuantitativa de la droga con una sensibilidad menor a 0,5 mg mL-1. Esto dio lugar al desarrollo de un procedimiento fácil de preparación de muestras para estudios farmacocinéticos en pacientes con insuficiencia renal crónica [58]. Paulos y col. cuantificaron NFX en plasma humano a partir de una técnica HPLC-UV, obteniendo una R%= 90,6%, LD= 77 ng mL-1 y RSD (%) intra-interdía de 3,5 y 4%, respectivamente.
La determinación de cuál es la concentración real de BNZ o NFX en plasma es un punto especialmente relevante en el contexto de esta Tesis, ya que sería muy importante conocer si los límites
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de detección (LD) y cuantificación (LQ) alcanzados por los diferentes procedimientos analíticos
actualmente disponibles son suficientes o se deben mejorar (bajar). Esto significa que se requiere del desarrollo de técnicas con límites de detección muy bajos, adecuados para obtener conclusiones válidas para la aplicación clínica. En este sentido, las técnicas de preconcentración se vuelven necesarias en el momento del abordaje de matrices complejas con bajas concentraciones de los analitos. Aparentemente, existen dos contextos diferentes: las concentraciones plasmáticas en adultos y en niños. Originalmente se propuso un rango terapéutico entre 3 y 6 mg mL-1 en las muestras de plasma de un adulto, para ambas drogas, sobre la base de datos in vitro y resultados de estudios farmacocinéticos, pero valores más bajos fueron observados en los pacientes pediátricos [49, 59, 60]. Recientemente, Altcheh y col. informaron una alta concentración de BNZ en plasma pediátrico, a diferencia de las bajas concentraciones informada en adultos. Por lo tanto, la concentración plasmática de estas drogas en el límite inferior de
significancia clínica todavía debe determinarse definitivamente, especialmente en el área pediátrica [60].
Como se ha comentado, la leche materna humana es una muestra biológica de gran importancia para el análisis de estos medicamentos, ya que la exposición no deseada a este alimento puede resultar en efectos farmacológicos en el lactante. El objetivo del análisis de estas drogas en leche materna es investigar el nivel de exposición del recién nacido a un fármaco durante la lactancia y también evaluar los riesgos potenciales de la terapia. De todos modos, la evaluación de los posibles riesgos para el recién nacido y los lactantes no se limita sólo a la determinación de las concentraciones de la droga en la leche, sino que también debe incluir estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos (ej. reacciones adversas), y los riesgos potenciales de interrupción de la lactancia materna, entre otros factores. Por estas razones, la valoración de riesgos requiere el conocimiento exacto de las concentraciones de estos fármacos en la leche materna para poder estimar la exposición infantil.
El traslado de drogas desde el plasma humano a la leche materna se produce principalmente por difusión pasiva según el peso molecular, ionización del fármaco, solubilidad en lípidos, proteína vinculante y flujo sanguíneo mamario [61–64]. Sin embargo, se desconoce hasta qué punto NFX o BNZ son transportados a la leche materna. Sin este conocimiento, la mayoría de los médicos que tratan a pacientes adultos con enfermedad de Chagas, se niegan a tratar a las mujeres durante la lactancia. De hecho, en ninguno de los pocos formularios que incluyen BNZ ó NFX (ej. formulario modelo de WHO; http://apps.who.int/medicinedocs/documents/) indican que no es compatible con la lactancia. En definitiva, el formulario no facilita ninguna información en lactancia, o declara que no es compatible
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debido a la falta de datos suficientes. Sin embargo, partiendo de un análisis teórico, se supone que la transferencia de NFX a la leche materna es limitada y que es improbable que conduzca a una exposición significativa de los infantes [46].
La falta de información sobre la transferencia de estas drogas a la leche materna y el potencial impacto publico sobre la salud que podría proporcionar el tratamiento de lactantes con enfermedad de Chagas, nos plantea un ensayo clínico para estudiar el grado de transferencia de estas drogas. En este contexto, se necesita desarrollar un procedimiento adecuado para el tratamiento previo de la muestra con un posterior método de análisis para la determinación confiable de estas drogas en esta matriz biológica, caracterizada por su complejidad y variabilidad.