La mayoría de los compuestos exógenos que se perfundieron sobre la preparación fueron disueltos previamente a alta concentración (10-50 mM) en sus respectivos disolventes (agua ultrapura o DMSO) y posteriormente conservadas en alícuotas a –20 ºC hasta su posterior utilización. Todas las sustancias fueron diluidas a su concentración final en LCRA oxigenado instantes antes de ser perfundidas en la preparación.
En el caso del anestésico sevoflurano (Abbott Laboratories, Kent, UK) no se siguió el método general de perfusión al tratarse de un compuesto gaseoso. Por ello el sevoflurano tuvo que ser vaporizado en carbógeno en un porcentaje de volumen determinado a través de un vaporizador específico (Quick FilTM Dräger Vapor 19.n). Esta mezcla gaseosa se burbujeó en LCRA en un depósito secundario hasta ser perfundido a la médula espinal.
Las peculiaridades de las sustancias utilizadas, los tiempos de aplicación de las mismas, así como la forma de aplicación, se detallan en los capítulos sucesivos en los que se utilizaron.
Materiales y Métodos. 7.- EXTRACCIÓN Y REGISTRO DEL NERVIO SAFENO.
El nervio safeno es un nervio fundamentalmente sensorial que se utilizó para realizar estudios de umbrales de activación de fibras nerviosas, que posteriormente fueron de gran utilidad para estimular de forma adecuada la raíz dorsal de la médula espinal. El nervio safeno se extrajo de ratones de 30 días de edad anestesiados con uretano (2 g/Kg, i.p.) siguiendo el protocolo detallado en Rivera y col. (2000). Extracciones realizadas en animales de menor edad fueron infructuosas, por lo que los datos obtenidos con los ratones jóvenes se tomaron como referencia para los parámetros de estimulación. Una vez anestesiado el animal se retiró la piel y el tejido muscular que circunda el nervio con tijeras y pinzas de microcirugía bajo una lupa estereoscópica. Después de la eliminación de las ligaduras periféricas del nervio se procedió a cortar sus extremos distal y proximal, para posteriormente ser transferido a la cámara de registro, donde se mantuvo en condiciones in vitro mediante la perfusión constante de fluido intersticial sintético (FIS), a una temperatura de 23 ± 1ºC y oxigenado mediante la aplicación de carbógeno (95% O2-5% CO2). Tanto la cámara de registro como el sistema de perfusión y oxigenación fue el mismo que el utilizado para la médula espinal. La composición del FIS fue (en mM): NaCl (108); KCl (3.48); KH2PO4 (1.7); MgSO4 (0.7); CaCl2 (1.53); NaHCO3 (26); glucosa (5.5); gluconato sódico (9.6) y sacarosa (7.6) (Cervero y Sann, 1989).
Los extremos distal y proximal del nervio se introdujeron en electrodos de succión para su estimulación y registro respectivamente, utilizando el mismo sistema empleado para el registro de reflejos espinales que se detalla a continuación.
8.- ELECTRODOS DE REGISTRO Y ESTIMULACIÓN.
Los electrodos de succión se fabricaron a partir de capilares de boro-silicato (Clark Electromedical Instruments, GC120-10) modificados a la llama para que se ajustaran lo mejor posible al grosor de la raíz espinal. Todos los electrodos de succión se situaron sobre micromanipuladores mecánicos para el ajuste fino de su posición. Los electrodos de estimulación dorsal y registro ventral utilizados en cada experimento se eligieron individualmente para obtener el mejor ajuste posible.
Estos electrodos se denominan de succión al estar conectados a una jeringa cuya fuerza de succión se empleó para rellenarlos con el propio LCRA, y al mismo tiempo introducir la raíz en el electrodo. Las raíces se introdujeron en su mayor parte
Materiales y Métodos.
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en el electrodo, pero éste no tocó nunca la médula para evitar la estimulación o el registro de fibras de paso. El tamaño del electrodo utilizado tanto para la estimulación como para el registro de las raíces fue aquél que se ajustara al grosor de la raíz sin llegar a presionar la misma, de tal forma que no se perdiera información por el bloqueo mecánico de las fibras.
Para la estimulación de la raíz dorsal se empleó un electrodo lleno de LCRA al que se acopla una espiral de hilo de plata alrededor del mismo hasta su extremo distal, y otro hilo de plata en el interior en contacto con el LCRA. Entre ambos filamentos se generan los pulsos de corriente eléctrica que estimulan las fibras aferentes de la raíz dorsal. El electrodo de registro de la raíz ventral fue idéntico al dorsal, pero careció de los hilos de plata.
Para obtener registros de axones ascendentes se utilizaron microelectrodos de succión producidos a partir de capilares de boro-silicato sin filamento interno (Harvard Apparatus, UK), que fueron preparados en un aparato para estirar electrodos (Sutter Instrument Co., model P-97). Los electrodos estirados presentaron el extremo de registro ciego, por lo que éste era cortado con posterioridad con unas pinzas bajo una lupa estereoscópica a un diámetro externo aproximado de 10 ± 3 µm. El interior del microelectrodo se llenó con el propio LCRA a través de una jeringa con una aguja micrométrica.
Para realizar los registros de los axones ascendentes el microelectrodo se acopló a una jeringa de succión, y se situó sobre un micromanipulador mecánico al igual que los electrodos de registro de las raíces espinales. Una vez situado junto a la zona de sustancia blanca de interés se aplicó una ligera succión a través de la jeringa, lo que provocó la entrada de axones en la punta del microelectrodo, permitiendo el registro de su actividad eléctrica. La distancia entre el electrodo de estimulación y el microelectrodo de registro varió entre los 6 y 11 mm, dependiendo de la raíz dorsal estimulada y la longitud de la médula espinal extraída.
La estimulación eléctrica de la raíz dorsal generó una respuesta motora que se registró por el electrodo situado en la raíz ventral, y paralelamente inició el ascenso de información sensorial a núcleos superiores a través de vías ascendentes, cuyos axones fueron registrados a través del microelectrodo situado en la sustancia blanca.
Materiales y Métodos.
El polo de referencia de todos los electrodos de registro fue un electrodo de plata que se encontraba en la cámara de registro.