La generación de metástasis requiere no solo de un aumento de la proliferación celular, sino tam- bién de cambios en la adhesión y migración celular. Durante el proceso migratorio se establece una interacción compleja entre el citoesqueleto de actina y los sitios de adhesión celular. Este proceso de recambio dinámico requiere de la participación de numerosas moléculas, entre las que se encuentran quinasas como FAK, Src y las GTPasas pequeñas de la familia Rho. Como indicamos, a las integrinas se unen proteínas de anclaje a las que posteriormente se une FAK, que tras su autofosforilación permite la unión y activación de Src. A su vez, Src fosforilará a FAK en nuevos residuos de tirosina permitien- do su máxima activación. A los complejos FAK/Src formados se unirán nuevas proteínas que a su vez verán modificadas su actividad y/o localización.
Los resultados de éste trabajo demuestran que en células PC-3, la anulación de AKT1 provocó una menor adhesión y migración celular, acompañado de una disminución en la capacidad de extensión celular. Desde el punto de vista molecular, se observó una menor fosforilación en el residuo Tyr397, en la Tyr861 y en menor proporción en la Tyr576 de FAK así como en la Tyr419 de Src. La menor fosforilación de la Tyr397 de FAK disminuiría la unión y posterior activación de Src, lo que explicaría el descenso en la fosforilación de otros residuos de FAK.
Como consecuencia de la desactivación global de FAK se generarán menos complejos FAK/Src, lo que dará como resultado una incapacidad de unión de p130Cas. Es esperable que en consecuencia disminuya la fosforilación de esta última, lo que provocará una menor unión de proteínas adaptadoras de la familia Crk que regulan, junto con la propia FAK, los GAFs y GEFs responsables de los ciclos de activación y desactivación de las GTPasas pequeñas de la familia Rho80.De hecho, nuestros resultados demuestran que la anulación de AKT1 provocó una disminución en los niveles de RhoA y Rac1 unidas a GTP (“activas”), lo que afectará claramente a la reorganización del citoesqueleto de actina. Todas éstas alteraciones moleculares pueden ser responsables de la pérdida de adhesión así como de la disminución en la extensión y la migración celular que se observó al anular AKT1.
Clásicamente se ha aceptado que AKT es un efector indirecto de FAK ya que p85 se une a FAK fosforilado activándose así PI3K y, en consecuencia, AKT194. Sin embargo, nuestros datos demuestran que FAK y Src pueden ser también efectores de AKT, mas concreto de AKT1. En realidad las dos posibilidades serían factibles ya que nosotros mostramos que todas éstas quinasas, es decir, FAK, Src y la subunidad p85 de PI3K y AKT1 forman un complejo de señalización. La generación de ésta plataforma permitirá múltiples interacciones entre las proteínas implicadas que podrían funcionar no sólo como quinasas, sino como proteínas de anclaje.
En este sentido, recientemente se ha descrito que, en células de cáncer colorrectal, la formación de complejos entre AKT, FAK y Src permite aumentar la fosforilación en tirosinas de FAK, en un proceso
Implicación de las isoformas de AKT en la regulación de la adhesión, extensión y migración celular.
que depende de Src195. A su vez, también se ha demostrado que AKT fosforila a FAK en residuos de serina196. Por otra parte, también se ha descrito que AKT requiere fosforilación en tirosinas para su completa activación107, y que Src puede ejercer funciones de regulación sobre la propia AKT197. Incrementando la complejidad del núcleo de señalización que parece formarse, debemos recordar que se ha demostrado que PI3K regula la familia de GTPasas Rho, sobre todo actuando sobre distintos GEFs y GAPs y que también se ha propuesto a FAK como un interruptor molecular en la regulación de dichos factores94.
Por todo lo indicado anteriormente, no parece extraño que la generación de una plataforma de se- ñalización, compuesta por varias proteínas, sea más importante que la regulación directa entre sustrato y efector. Así, AKT1 podría tanto interactuar como servir de anclaje para otras proteínas, como FAK y Src. Éstas últimas, convenientemente cercanas, podrían fosforilarse y activarse, a la vez que podrían regular a la propia AKT1. En consecuencia, la ausencia de esta isoforma puede provocar una desor- ganización global de las plataformas generadas, dando como resultado una incapacidad de conexión entre las señales externas y el interior celular que, en última instancia, lleva al desprendimiento de las células acompañada de una mayor sensibilidad a sufrir algún fenómeno de muerte celular.
Con respecto al último punto, nuestros resultados indican que las células donde se produjo la inhi- bición de AKT1, no sólo se desprendieron más de su sustrato, sino que fueron más sensibles aanoikis
ó muerte por pérdida de adhesión. Éste proceso puede ser responsable de la inhibición de la prolifera- ción celular detectada al anular AKT1, que no implicaba modificación del ciclo celular. Las células PC-3 presentan una elevada resistencia a la muerte tras desprenderse de su sustrato, proceso que depende de algunas moléculas claves como Src ó FAK198. En éste sentido, se ha demostrado que el estado de oxidorreducción desregulado en PC-3 lleva a una activación constitutiva de Src que podría permitir a la célula sobrevivir en suspensión199. Por su parte, también se ha demostrado que en células PC-3, FAK debe ser fosforilado para que las mismas no mueran al estar en suspensión200. Finalmente, Liu y cols.201demostraron que, en fibroblastos, la ausencia de AKT1 inhibe el crecimiento independiente de anclaje. Considerando estos datos, así como los resultados de nuestro trabajo, podemos postular que la resistencia de las células PC-3 a sufrir apoptosis tras desprenderse de su sustrato depende de AKT1 y de las interacciones generadas en la plataforma de señalización integrada por FAK, Src y la propia AKT1.
Por su parte, y al contrario que AKT1, en la células PC-3 la anulación de AKT2 incrementó la mi- gración y disminuyó la extensión celular, sin provocar cambios en la adhesión, ni en la resistencia al
anoikis. Con respecto a los efectores moleculares, únicamente se observó un aumento la fosforilación de FAK en la Tyr861, sin modificaciones en la fosforilación de Src.
Ya en 2001, se demostró que la fosforilación del residuo Tyr861 de FAK se asocia a la alta capacidad migratoria que presentan las células PC-381. Además ésta una modificación de suma importancia para la interacción de FAK con p130Cas. A ésta última se unirá la proteína adaptadora Crk que reclutará a la proteína DOCK180, una GEF que finalmente promueve la activación de Rac1202. En concordancia,
nuestros resultados demuestran que cuando se anuló AKT2 hubo un aumento en los niveles de Rac1 activa.
En éste trabajo también se observó un ligero aumento en los niveles de RhoA activo al anular AKT2. Aunque se han propuesto algunas acciones opuestas entre RhoA y Rac1 con respecto a la migración celular, se ha demostrado que la activación de RhoA es esencial para la transcripción de genes, dependientes del factor de transcripción NFκB, implicados en el fenotipo invasivo de las células PC-3203.
Es evidente que el silenciamiento de AKT2, en comparación con el de AKT1, provoca solo ligeros cambios en la maquinaria migratoria; además la localización de esta isoforma en el núcleo no parece estar en concordancia con la regulación de las GTPasas y/o efectores de localización citoplasmática. Sin embargo, debemos tener en cuenta que recientemente se ha demostrado que ciclina D y p27, cuyos niveles se ven drásticamente modificados al silenciar AKT2, están directamente implicadas en el control de la migración celular y aunque el efecto producido y el mecanismo utilizado no esta claro, parece que estarían implicadas RhoA y Rac53, 204.
Interrelación entre las vías PI3K/AKT y la fosfotirosina fosfatasa SHP-1.