La extracción, disposición y mantenimiento en condiciones in vitro del nervio safeno y de la médula espinal en la cámara de registro, así como sus puntos de estimulación y registro, ya han sido explicados en la sección de materiales y métodos generales (apartados 5 y 7, páginas 41 y 43).
2.1.- Registro del Nervio Safeno.
Los nervios safenos (n=3) se extrajeron de ratones CD-1 de 30 días de edad y un peso de 28.4 a 30 gramos. La longitud de los nervios registrados fue de 8.4, 9.5 y 12 milímetros. La temperatura media del fluido intersticial sintético (FIS) durante el registro de la respuesta nerviosa fue de 23.7 ± 0.6 ºC.
Resultados. Capítulo 1.
El primer estudio realizado en los nervios safenos se basó en un análisis de su respuesta a estimulación máxima (500 µs y 500 µA), de esta forma se activaban todas las fibras del nervio y pudieron distinguirse sus componentes principales. Esta estimulación se repitió 10 veces en intervalos de 1 minuto, posteriormente los registros se promediaron para obtener una respuesta final (figura 22-A).
Tras 15 minutos de reposo se llevó a cabo un estudio de la respuesta del nervio a diferentes intensidades de estimulación. Para ello se aplicaron estímulos eléctricos de una duración fija de 200 µs y de una intensidad creciente de 10, 50, 100, 150, 200 y 250 µA. Cada estímulo se repitió tres veces con una separación mínima de 30 segundos para estímulos inferiores a 100 µA, 45 segundos para estímulos entre 100 y 200 µA, y 60 segundos para estímulos de 250 µA (figura 19). Tras el estudio se midió la longitud del nervio para determinar la velocidad de conducción de los diferentes tipos de fibras aferentes, basándose en las latencias de las respuestas registradas.
500 µµµµs 500 µµµµA 10 µµµµA 50 µµµµA 100 µµµµA 150 µµµµA 200 µµµµA 250 µµµµA
Figura 19.- Protocolo de estimulación del nervio safeno. Tras los diez estímulos máximos iniciales (500 µs
y 500 µA), se aplicaron grupos de tres estímulos de intensidad creciente con una duración fija de 200 µs.
2.2.- Registro de Reflejos Espinales.
Para estudiar la respuesta registrada en la raíz ventral de este nuevo modelo se aplicó una batería de estímulos unitarios y repetitivos de diferentes intensidades a la raíz dorsal. El primer parámetro estudiado fue la intensidad umbral, definida como la intensidad mínima de estimulación, en µA, que produce una respuesta visible en las motoneuronas utilizando una duración fija del estímulo de 200 µs. A continuación se realizó un estudio de la respuesta ventral a estímulos unitarios de baja intensidad (50 ó 200 µs e intensidad umbral + 20 µA) y de alta intensidad (normalmente 200 µs y 200 µA), para determinar el tipo de respuesta y compararla con la obtenida a diferentes intensidades. Los estímulos unitarios se repitieron tres veces como regla general, con una separación temporal mínima de 30 segundos para estímulos con una intensidad inferior a 50 µA, y una separación mínima de 60 segundos para estímulos que superen esta intensidad (figura 20-A).
Resultados. Capítulo 1.
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Para determinar el tipo de respuesta ventral tras la estimulación repetitiva de la raíz dorsal, se aplicaron trenes de estímulos de diferente intensidad y duración (50 µs y 50 µA; 100 µs y 100 µA; 200 µs y 200 µA; 300 µs y 300 µA) con una separación temporal mínima entre los mismos de 5 minutos para los estímulos de 50 y 100 µA, y de 15 minutos para los estímulos de 200 y 300 µA. Tras 30 minutos de descanso, se volvió a aplicar esta estimulación por segunda vez a la médula espinal. Todos los trenes de estimulación constaban de 20 estímulos con una frecuencia de 1 Hz.
Los estímulos que más podían alterar la respuesta de la médula espinal son los trenes de estímulos de alta intensidad. Para estudiar si estos estímulos pueden provocar variaciones en la respuesta con las repeticiones sucesivas, tanto provocando una potenciación como una inhibición de la misma a lo largo del tiempo, se realizó un estudio consistente en aplicar trenes de estímulos de 200 µs y 200 µA cada 15 minutos, un total de 12 veces. De esta forma se buscaba conocer si el número total de potenciales de acción disparados, así como el área acumulada, sufrieron variaciones significativas en un periodo temporal (3 horas) similar al que puede durar un experimento estándar (figura 20-B).
Umbral Baja I Alta I 50µµµµs 50µµµµA 100µµµµs 100µµµµA 200µµµµs 200µµµµA 300µµµµs 300µµµµA
A
200µµµµs 200µµµµA
t = 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
B
Figura 20.- A Protocolo para estudiar la respuesta ventral de una médula espinal de ratón. B Protocolo
para estudiar la estabilidad de la respuesta ventral de una médula espinal de ratón durante la aplicación secuencial de estímulos repetitivos de alta intensidad.
2.3.- Registro de Axones Ascendentes.
En este apartado se emplearon un total de 26 médulas espinales extraídas a partir de ratones con una edad comprendida entre 6 y 17 días, y un peso de 3.7 a 9 gramos. Para el estudio y clasificación de los axones ascendentes se realizaron una serie de test tendentes a determinar el umbral de activación de los mismos, su
Resultados. Capítulo 1.
respuesta a estímulos de baja y alta intensidad, así como la evolución de la respuesta a estimulación repetitiva. En los estudios de intensidad umbral, se utilizó una duración de estimulación fija de 200 µs, y se define como la intensidad mínima necesaria para provocar que el axón dispare como mínimo un potencial de acción. A continuación, se estudió la respuesta del axón mediante la aplicación de tres estímulos de baja intensidad (50 µs y 50 µA) con una separación de 30 segundos, y tres estímulos de alta intensidad (200 µs y 200 µA) con una separación de 60 segundos. De esta forma se obtuvieron las principales características de la respuesta del axón ascendente: número de potenciales de acción disparados tras estimulación de alta y baja intensidad, latencia (medida en estímulos de alta intensidad) y duración de la respuesta. Por último se estudió la respuesta de los axones a estimulación repetitiva de baja (50 µs y 50 µA) y alta intensidad (200 µs y 200 µA), para determinar si la respuesta obtenida era de tipo wind up (suma o aumento progresivo de potenciales de acción), o si mantenía o disminuía progresivamente la respuesta inicial (figura 21).
Umbral Baja I Alta I Baja I Alta I
Figura 21.- A Protocolo para estudiar la respuesta de los axones ascendentes a través de la aplicación de
estímulos de baja (50 µs y 50 µA) y alta intensidad (200 µs y 200 µA). Ver más detalles en el texto.
2.4.- Parámetros y Cálculos Utilizados.
Los principales parámetros utilizados para cuantificar los resultados de los experimentos de los registros de reflejos espinales son el número de potenciales de acción, el área (despolarización) y la amplitud del RMS. En el caso de los axones ascendentes, el parámetro utilizado para cuantificar su respuesta es el número de potenciales de acción disparados. El parámetro estudiado para cuantificar la respuesta en los nervios safenos es la amplitud de las ondas registradas. En todos estos parámetros también se estudia su umbral y latencia. Su cuantificación se realiza a través de programas semiautomáticos construidos en el contexto Spike-2. Los datos se muestran como la media ± EEM, y las comparaciones estadísticas se han realizado mediante ANOVA de una vía y el test t de Student (t-test).
Resultados. Capítulo 1.
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3.- RESULTADOS.