CHAPTER 2 RESEARCH METHODOLOGY 16
2.9 ETHICAL ISSUES 40
Se realizará:
A.3.1. Caracterización de cepas micotoxicogénicas A.3.2. Incidencia de géneros micotoxicogénicos,
A.3.3. Evaluación de capacidad aflatoxicogénica “in vitro”
A.3.1. Caracterización de cepas potencialmente micotoxigénicas
Las cepas de los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium, considerados potencialmente micotoxigénicos, aislados durante el RFT se repicaron a picos de PDA y se guardaron para su caracterización a nivel de especies.
Se comenzó la clasificación taxonómica empleando las claves simplificadas y unificadas para los diversos géneros fúngicos, propuesta por Pitt&Hodking, 1997.
A partir de un pico de PDA conteniendo el desarrollo fúngico de 7 días de la cepa a clasificar se preparó una suspensión cargada de esporas en agar semisólido (Agua + Agar al 0,5%). Se realizaron los repiques a los medios de cultivo apropiados según el género a clasificar y siguiendo el esquema de siembra de Pitt, figura A.3.1.
Las siembras se realizaron empleando un ansa aguja y realizando una punción central con la placa invertida. Se tuvo la precaución de trabajar con placas de vidrio para evitar la dispersión de las esporas por atracciones electrostáticas en las placas de plástico. Se incubaron las placas a la temperatura correspondiente, durante 7 días.
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Figura A.3.1.
Figura A.3.1. Esquema de siembra de Pitt y Hodkin (1997). Esquema de siembra de Pitt y Hodkin (1997).
1 1 1 CYA MEA 1 1 1 MEA 2 2 2 CYA 2 2 2 CYA 1 2 2 1 1 2 2 CYA 1 1 2 2 CYA 1 1 2 2 G25N 25ºC 25ºC 25ºC 25ºC 37ºC 25ºC 5ºC
Se realizó la inspección de todas las placas sembradas anotando las características macro- microscópicas en tablas confeccionadas a tal fin. Con todos los datos se ingresó a las claves taxonómicas (Klich, 2002; Pitt y Hodking, 1997; Pitt, 1988) adecuadas y se realizó la identificación de las especies de las cepas.
Las cepas que no pudieron clasificarse con éste esquema se caracterizaron empleando claves más completas para cada género en particular.
Para la clasificación de especies de Aspergillus se utilizó la clave “Identification of common
Aspergillus species” (Klich, 2002) que emplea tres medios de cultivo a tres temperaturas
diferentes. Los medios de cultivo empleados y sus correspondientes temperaturas de incubación se presentan en la tabla lI.
Tabla A.3.I:
Tabla A.3.I: Medios de cultivo y temperaturas de incubación para Aspergillus.Medios de cultivo y temperaturas de incubación para Aspergillus.
SIGLA MEDIO DE CULTIVO Incubación a
25 ºC
Incubación a 37 ºC
Incubación a 5 ºC CYA Agar Czapek Extracto de levadura
(Pitt, 1973)
Si Si Si
MEA Agar Extracto de Malta (Blakeslee, 1915)
Si No Si
CY20S Agar Czapek Extracto de levadura con 20 % sucrosa
(Pitt&Hocking, 1985)
Si No No
Para la clasificación de especies de Penicillium se procedió de acuerdo al esquema de Pitt y Samson sembrando la cepa incógnita en tres medios de cultivo e incubando las placas a tres temperaturas diferentes (Pitt y Hodking, 1997; Pitt y Samson, 1990) (tabla lII).
Tabla A.3.ll.
Tabla A.3.ll. Medios de cultivo y temperaturas de incubación para Penicillium.Medios de cultivo y temperaturas de incubación para Penicillium.
SIGLA MEDIO DE CULTIVO Incubación a
25 ºC
Incubación a 37 ºC
Incubación a 5 ºC
CYA Agar Czapek Extracto de
Levadura (Pitt, 1973) Si Si Si
MEA Agar Extracto de Malta
(Blakeslee, 1915) Si Si Si
G25N Agar Nitrato 25 % Glicerol
(Pitt 1973) Si Si Si
Para la clasificación de especies de Fusarium se procedió de acuerdo al esquema de Nelson en “Fusarium species. An illustrated manual of identification” sembrando la cepa incógnita en los medios de cultivo adecuados e incubando las placas a las temperaturas propuestas, cuidando los ciclos de luz-oscuridad (Nelson y col, 1983).
A.3.2. Incidencia de géneros micotoxicogénicos,
La incidencia de géneros micotoxicogénicos se estimó mediante el Porcentaje de incidencia de géneros micotoxigénicos (PIM), que se definió como:
PIM = Número de muestras infectadas con géneros micotoxicogénicos x 100 Número total de muestras de la etapa evaluada
Los hongos micotoxigénicos corresponden a los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Este mismo indicador se empleó para establecer el porcentaje de incidencia de
cepas del género Aspergillus (PIA), porcentaje de incidencia de cepas del género Penicillium (PIP), porcentaje de incidencia de cepas del género Fusarium (PIF).
A.3.3. Evaluación de capacidad aflatoxicogénica “in vitro”
Las cepas caracterizadas como Aspergillus flavus y/o parasiticus, fueron sometidas a la prueba del mini arroz para evaluar su capacidad de biosintetizar aflatoxinas in vitro.
Preparación de las cepas: las cepas a ensayar se desarrollan en picos de flauta de medio
Czapeck a 28 ºC durante 5 a 7 días.
Preparación de las plaquitas: el medio natural, arroz pulido, se prepara de la siguiente manera:
plaquita
de Petri 2,5 gr Arroz Pulido
2,5 ml agua Inoculación central con ansa cargado de esporas plaquita
de Petri 2,5 gr Arroz Pulido
2,5 ml agua
1º) Figura 1
Figura 2
Se pesan 2,5 gr de cereal colocándolos en placas de Petri pequeñas y se esterilizan en autoclave. Se agrega a cada placa 2,5 ml de agua destilada estéril. Mediante movimientos laterales suaves se permite que todo el sustrato sea humedecido (figura A.3.2.a). Se realiza la inoculación central con un ansa cargado de esporas de la cepa de Aspergillus en estudio (figura A.3.2.b).
Extracción y detección de aflatoxinas: la extracción de las toxinas, se realizó mediante:
1) La adición de 10 ml de cloroformo a cada plaquita de Petri.
2) Se homogeneizó durante 10 minutos macerando con varilla de vidrio el crecimiento fúngico y los granos de cereal hinchados por la humedad.
3) Se filtró a través de papel de filtro Watman Nº 1, recogiendo el filtrado en un recipiente apto para evaporar el solvente.
4) Se evaporó el cloroformo, a sequedad mediante el empleo de baño de vapor de 85 ºC. 5) Se resuspendió el extracto obtenido en 200 µl de Benceno:Acetonitrilo (98:2).
La detección de las aflatoxinas se realizó sembrando 20 µl del extracto resuspendido en el paso anterior, sobre cromatoplacas de sílica gel 60 sin indicador de fluorescencia, junto a patrones puros de aflatoxina B1 de concentración conocida. Se separan las toxinas empleando Tolueno:Acetona:Cloroformo (30:20:150) como mezcla de solvente y se identifican las distintas aflatoxinas observándolas bajo luz UV a 365 nm por comparación visual con los patrones de aflatoxina B1. Se realizó una confirmación con Acido Sulfúrico al 30% por aspersión y cambio de fluorescencia al amarillo.
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(a)
(b)
Figura A.3.2.