Experimental Evaluation

Con el fin de estudiar los vSLAM identificados en el contexto de la infección, en primer lugar se establecieron sistemas de infección con SMCMV y OMCMV en líneas celulares in vitro. Se ha descrito que tanto SMCMV como OMCMV infectan células epiteliales del mono ardilla (SMK) y OMK, respectivamente, y en menor grado son también capaces de crecer en células humanas tales como células Vero o células HEL299 (Daniel et al., 1971; Rangan et al., 1980). Debido a las dificultades para obtener células SMK, se emplearon células HEL299 para las infecciones de SMCMV y células OMK para las infecciones de OMCMV. Como se muestra en la Figura 25 A, ambos virus fueron capaces de crecer, diseminarse, formar placas de lisis y finalmente, produciendo un efecto citopático de la monocapa celular. Un análisis de las cinéticas de crecimiento de SMCMV y OMCMV en células HEL299 y OMK, respectivamente, indicó que a día 15 post-infección (pi) en el caso de SMCMV y a día 11 pi para OMCMV se alcanzan los picos máximos de crecimiento viral, obteniéndose en ambos casos unos títulos de alrededor de 4x106 UFP/mL (Figura 25 B). Estos datos permitieron optimizar la recogida de sobrenadantes para la generación de stocks virales.

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Días pi

Figura 25. Crecimiento de SMCMV y OMCMV en células HEL299 y OMK. (A) Placas de lisis y efecto citopático de

cultivos celulares infectados por SMCMV u OMCMV. Se emplearon células HEL299 y OMK sin infectar (Mock, paneles a,d) o infectadas a una MOI de 0.2 con SMCMV u OMCMV. Se analizaron en un microscopio óptico usando un objetivo de 20x para visualizar las placas de lisis (paneles b, e), o las células citopáticas (paneles c, f). (B) Cinéticas de crecimiento de SMCMV y OMCMV. Cultivos de HEL299 y OMK se infectaron con SMCMV y OMCMV a una MOI de 0.05. A los diferentes tiempos post-infección indicados, se determinó la cantidad de virus infectivo extracelular presente en los cultivos mediante titulación por placas de lisis. Cada punto representa la media con su correspondiente desviación estándar de tres cultivos independientes.

Una vez establecidas las infecciones de SMCMV y OMCMV, se quiso determinar si los genes vSLAM se expresaban durante la infección. Para ello, se analizaron por RT-PCR muestras de células HEL299 infectadas con SMCMV, y muestras de células OMK infectadas con OMCMV. El RNA total fue extraído de células no infectadas o infectadas durante 3 días por SMCMV u OMCMV, retrotranscrito a DNA y amplificado con oligos específicos para los distintos vSLAM (descritos en material y métodos, apartado 4.2.2.2). Como controles se emplearon oligonucleótidos diseñados para amplificar el gen inmediatamente temprano (IE1)

Mock 7 días pi 11 días pi Mock 11 días pi 17 días pi

O M C MV S M C MV

A

B

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específico para cada CMV, y para el gen celular GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Como se observa en la Figura 26, todos los transcritos para los siete vSLAM fueron indetectables en células sin infectar, mientras que fueron claramente identificados en las muestras celulares infectadas.

Figura 26. Detección de los vSLAM en células infectadas por SMCMV u OMCMV. Se emplearon células HEL299

sin infectar (mock) o infectadas con SMCMV o OMCMV a una MOI de 0,5. El RNA total fue obtenido a los 3 días post- infección, tratado con DNasa y retrotranscrito a cDNAutilizando oligo(dT) y la enzima retrotranscriptasa. A continuación se realizaron PCRs con oligonucleótidos específicos para S1, S30, S31, SMCMV IE1, A33, A43, A44, A45, OMCMV IE1 y GAPDH. Los productos amplificados fueron separados en geles de agarosa al 1% y visualizados con marcaje SYBR green. No se detectó ningún producto en las muestras controles que no habían sido tratadas con la enzima retrotranscriptasa durante el proceso (datos no mostrados).

Una vez confirmada la expresión de los siete vSLAM durante la infección, nos planteamos la generación de anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra algunas de estas proteínas virales, para detectarlas en células infectadas o para otros usos experimentales. En concreto elegimos con tal fin S1 y A43, ya que eran las dos proteínas virales que presentaban una identidad mayor con sus respectivos homólogos celulares. Se siguieron dos estrategias de inmunización distintas. Para S1 se usaron como inmunógeno las células 300.19 de ratón que expresaban establemente S1 en su superficie (300.19 HA-S1), generadas mediante transfección con el plásmido HA-S1 y su posterior selección con neomicina y subclonaje (datos no mostrados). En cambio, para A43 se empleó la proteína de fusión A43-Fc purificada como inmunógeno, consistente en los dos dominios Ig de A43 fusionados a la región Fc de la IgG1 humana. Tras las sucesivas inmunizaciones, se llevó a cabo la fusión de la línea celular de mieloma NS1 con esplenocitos de los ratones inmunizados, tal y como se detalla en el apartado 4.2.4 de material y métodos. Las células resultantes de las fusiones fueron mantenidas en medio selectivo y una vez crecidas, se analizaron las distintas clonas obtenidas. Estos primeros screening consistieron en seleccionar aquellos hibridomas que producían anticuerpos reactivos contra los inmunógenos utilizados. Se llevaron a cabo mediante citometría de flujo y usando la línea celular 300.19 HA-S1 o, en el caso de A43, mediante ELISA y empleando la proteína A43-Fc como antígeno. De este proceso se obtuvieron 5 hibridomas positivos para S1 (Figura 27). También se detectaron 5 hibridomas

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positivos para A43-Fc, pero todos fueron descartados al ser únicamente reactivos contra la región Fc de la IgG1 humana en vez de con A43. Por último, debido a la alta homología compartida en los dos dominios Ig de S1 y sbSLAMF6, se quiso determinar si estos anticuerpos frente a S1 generados reconocían también al homólogo celular sbSLAMF6. Para ello, se generaron mediante selección con neomicina células 300.19 que expresaban establemente el plásmido HA-sbSLAMF6-Tm, consistente en los dos dominios Ig de sbSLAMF6 obtenidos por síntesis química fusionados al epítopo HA por el extremo N-terminal y al dominio transmembrana incluido en el propio vector de expresión por el extremo C-terminal. Los resultados de este segundo screening mostraron que 4 de estos anticuerpos reconocían epítopos compartidos entre S1 y sbSLAMF6 y por tanto ambas proteínas, mientras que uno de ellos solo reconocía S1.

Figura 27. Anticuerpos monoclonales generados frente a S1. (A) Panel de los hibridomas frente a S1 obtenidos. Se

indica el nombre del anticuerpo secretado por los hibridomas y la proteína que reconoce. (B) Análisis representativo por citometría de flujo del marcaje específico de S1 y sbSLAMF6. Citometría de flujo de células 300.19 sin transfectar o transfectadas establemente con HA-S1 o HA-sbSLAMF6-Tm marcadas con S1.1.188 o S1.1.6 cuando se indique, seguidos de un anti-IgG PE. Los histogramas en blanco representan controles isotípicos y el porcentaje de células positivas está indicado en cada histograma.

A continuación caracterizamos el anticuerpo S1.1.188 para determinar los posibles usos del mismo. Con tal fin, fue probado en otras técnicas que no fueran citometría, como inmunocitoquímica, WB e inmunoprecipitación. En primer lugar, se analizaron por inmunocitoquímica células 300.19 o 300.19 HA-S1 utilizando el anticuerpo S1.1.188. Los resultados obtenidos mediante microscopía confocal mostraron que S1 es detectado en la superficie de las células 300.19 HA-S1 (Figura 28 A). Por otro lado, los lisados de células 300.19 y 300.19 HA-S1 previamente biotinadas, fueron inmuonoprecipitados con el anticuerpo S1.1.188. Seguidamente, se realizó un tratamiento con la enzima N-glicosidasa F a parte de la muestra obtenida de la inmunoprecipitación. Mediante WB y utilizando estreptavidina-POD obtuvimos dos banda de S1 de igual peso molecular que las determinadas previamente con los conjugados de anti-HA-agarosa (Figura 28 B). Por último, empleamos el anticuerpo S1.1.188 para detectar S1 en extractos de células 300.19 HA-S1 analizadas por WB, obteniéndose

Anticuerpo Proteína reconocida S1.1.188 S1 S1/sbSLAMF6.1. 6 S1 y sbSLAMF6 S1/sbSLAMF6.3.76 S1 y sbSLAMF6 S1/sbSLAMF6.3.191 S1 y sbSLAMF6 S1/sbSLAMF6.3.539 S1 y sbSLAMF6

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también la misma banda (Figura 28 C). Por tanto, podemos concluir que el anticuerpo S1.1.188 funciona por citometría de flujo inmunocitoquímica, inmunoprecipitación y WB.

Figura 28. Caracterización del anticuerpo S1.1.188. (A) Células 300.19 sin infectar (300.19) o establemente transfectadas con HA-S1 (300.19 HA-S1) fueron fijadas con formaldehido al 4% y marcadas con el anticuerpo anti-S1 seguido de anti-IgG-Alexa-555 (rojo). Los núcleos se marcaron con Hoechst (azul). Las células fueron examinadas por microscopía confocal a 405 nm (Hoechst) y a 510-560 nm (Alexa-555). Se muestran las células marcadas con el anticuerpo anti-S1 (paneles c y d), con marcaje de núcleos con Hoechst (paneles a y b) y el merge de ambos marcajes (paneles e y f). Las imágenes fueron capturadas a 40X. Barra, 10μM. (B) Extractos de células 300.19 sin transfectar (300.19) o trasfectadas establemente con HA-S1 (300.19 HA-S1) fueron biotinados e inmunoprecipitados con el anticuerpo anti-S1. Cuando se indica las muestras fueron tratadas con N-glycosidasa F (N-Gly F). A continuación fueron analizadas por SDS-PAGE, tranferidas a una membrana de nitrocelulosa e incubadas con estreptavidina-POD. (C) Células 300.19 o 300.19 HA-S1 fueron lisadas y las muestras fueron analizadas por WB usando el anticuerpo anti- S1 seguido de un anti-IgG ratón POD. Los pesos moleculares están indicados (kDa).

Por último, con el objeto de determinar si el anticuerpo S1.1.185 reconocía esta proteínas durante la infección viral, se analizaron por inmunocitoquímica células HEL299 no infectadas o infectadas durante 72 horas con SMCMV, utilizando este anticuerpo. Tal y como se puede observar en la Figura 29A, los resultados obtenidos mediante microscopía confocal mostraron que S1 es detectado en las células HEL299 infectadas con SMCMV y se observó una distribución mayoritaria de esta proteína viral en la superficie celular. Adicionalmente, empleando el anticuerpo S1.1.188 por citometría de flujo, también fue detectado S1 en células HEL299 infectadas durante 72 horas con SMCMV (Figura 29B).

(kDa) 130 95 72 55 43 34 26 170 N-Gly F - + 300.19 300.19 HA-S1 - (kDa) 130 95 72 55 43 34 26 170 300.19 300.19 HA-S1 Actina

A

B

C

Resultados

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Figura 29. Detección de S1 en células infectadas por SMCMV. (A) Células HEL299 sin infectar (Mock) o infectadas

con SMCMV a una MOI de 0,2 durante tres días, fueron fijadas con formaldehido al 4% (paneles a-f) o fijadas y permeabilizadas con acetona (paneles g-l) y marcadas con el anticuerpo anti-S1 seguido de anti-IgG-Alexa-555 (rojo). Los núcleos se marcaron con Hoechst (azul). Las células fueron examinadas por microscopía confocal a 405 nm (Hoechst) y a 510-560 nm (Alexa-555). Se muestran las células marcadas con el anticuerpo anti-S1 (paneles b, e, h y k), con marcaje de núcleos con Hoechst (paneles a, d, g y j) y el merge de ambos marcajes (paneles c, f, i y l). Las imágenes fueron capturadas a 40X. Barra, 10μM. (B)Análisis por citometría de flujo de células HEL299 sin infectar (Mock) o infectadas con SMCMV a una MOI de 5 durante tres días. Las células fueron marcadas con anti-S1 (histogramas sombreados) o el control isotípico (histogramas abiertos), seguido de anti-IgG ratón-PE. El porcentaje de células positivas está indicado en cada histograma.

5.6. Análisis de las interacciones de los vSLAM de CMV con sus respectivos