Test Operating Conditions

Teniendo en cuenta la capacidad de A43 de bloquear la interacción entre h2B4 y hCD48, nos planteamos examinar la posibilidad de que A43 soluble, a través de este bloqueo, actuara como un decoy receptor, alterando la funcionalidad de las células que expresa h2B4. Para ello, realizamos un ensayo donde medimos la citotoxicidad de las células NK-92 contra las células diana K562 establemente transfectadas con hCD48 (K562 hCD48), tal y como se ha descrito en material y métodos (apartado 4.2.5.13). Debido a que las células diana K562 hCD48 expresan receptores Fc no se pudo emplear la proteína A43-Fc, y en su lugar se

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generó la proteína soluble A43-His, constituida por los dos dominios Ig de A43 fusionados al epítopo His. Así, las células NK-92 fueron incubadas durante 24 h con SN de células COS-7 transfectadas con A43-His. A continuación, fueron lavadas e incubadas durante 4h con células K562 hCD48 marcadas con calceina, en dos proporciones celulares de 1/1 y 2/1. Para finalizar, se midió la fluorescencia de la calceina presente en los SN de estos co-cultivos, obteniéndose mayor señal cuanto mayor era la lisis de las células diana y más calceina era liberada. Como controles, se utilizaron también células diana K562 que apenas expresan hCD48, y se determinó que los niveles de expresión de h2B4 en la superficie celular no eran alterados al incubar las células NK con A43 (datos no mostrados). Como podemos ver en la Figura 45, las células NK-92 incubadas con A43-His redujeron su citotoxicidad frente a las células K562 hCD48 y no frene a las K562 control. Por tanto, podríamos concluir que la proteína viral A43, debido a sus excepcionales propiedades de unión a h2B4, es una molécula viral capaz de bloquear la unión de h2B4 y hCD48, inhibiendo así la citotoxicidad mediada por esta interacción en células NK humanas.

Figura 45. Disminución de la citotoxicidad de las células NK-92 incubadas con A43-His. Células NK-92 fueron

incubadas durante 24h con SN concentrados de células COS-7 transfectadas con A43-His una semana antes (SN A43- His). Como SN control se transfectaron COS-7 con un plásmido vacío (SN CTL). Las células diana K562 y K562 hCD48 fueron incubadas durante 30 minutos con calceina. A continuación, fueron lavadas tanto las células NK-92 como las células diana e incubadas conjuntamente durante 4 h, en placas de 96 pocillos con fondo en V, en unas proporciones NK-92/célula diana de 1/1, y 2/1 y en un volumen final de 200 µl. Como control negativo se incubaron células diana sin células NK-92, para medir la liberación espontánea de calceina. Como control positivo, al terminar las 4h fueron lisadas con una solución de Tritón al 1% células diana incubadas en solitario. A las 4 horas los SN fueron recogidos y se midió la fluorescencia emitida por la calceina. Se ha representado el tanto por ciento de citotoxicidad de las NK-92 frente a las células diana calculado a partir de las intensidades de fluorescencia detectadas. Se han representado las medias y las desviaciones estándar de tres muestras independientes para cada condición. Los asteriscos indican que la diferencia entre ambos puntos es estadísticamente significativa. *, p<0,05.

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5.8. Análisis de la unión de A43 con el receptor CD2 humano

En base a los resultados obtenidos en el apartado 1.4 en los que se observaba una interacción de A43-Fc con células T JURKAT y linfocitos T de sangre periférica CD4+, ambos negativos para el receptor SLAM h2B4, se decidió tratar de identificar qué otra proteína humana interaccionaba con A43. Para ello, se examinó si esta proteína viral podía unirse al resto de miembros SLAM y a los receptores CD2 y CD58, los cuales, si bien no pertenecen a la misma familia que los receptores SLAM, sí que poseen una similitud estructural y un origen evolutivo común con ellos. Así, se transfectaron células COS-7 con plásmidos que permitían la expresión de CD150, CD48, LY9, CD84, SLAMF6, CD319, CD353, CD2, CD58 y como control positivo 2B4, y al incubar estas células con A43-Fc se detectó una unión específica e intensa únicamente con el receptor humano CD2 (Figura 46), datos de interacción negativos no mostrados), además de con h2B4. Este resultado iría en consonancia con los resultados obtenidos anteriormente ya que CD2 se encuentra expresado en linfocitos T CD4+. Además, es importante destacar que el ligando del receptor CD2 en ratón y en rata es CD48, el cual une además a 2B4. Mientras, en humano el ligando natural de CD2 es el receptor CD58, pero está descrito que CD48 también es capaz de unir a CD2 muy débilmente.

Figura 46. Interacción de A43 con hCD2. Citometría de flujo de células COS-7 sin transfectar o transfectadas con

hCD2, incubadas con anti-hCD2-PE (histogramas sombreados superiores) o con 8µg/ml de la proteína de fusión A43- Fc, seguido de anti-hFc y anti-IgG PE (histogramas sombreados inferiores). Los histogramas en blanco representan controles isotípicos y el porcentaje de células positivas está indicado en cada histograma. En la figura se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.

A continuación, se decidió determinar en qué líneas celulares utilizadas en los ensayos de interacción con A43-Fc se expresaba hCD2, h2B4 o ambos (Figura 47). Como se puede observar las células JURKAT, HSB2 y las NK-92 expresan ambos, las células JURKAT solamente expresan hCD2 y las células NK-YT únicamente h2B4. Este resultado es muy importante ya que los estudios de las constantes de unión realizados en células NK-YT a lo largo de este trabajo solo pueden ser explicados desde el contexto de la interacción h2B4-A43, y por lo tanto resultan válidos y concluyentes.

Resultados

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Figura 47. Expresión de los receptores hCD2 y h2B4 en líneas celulares humanas T y NK. Citometría de flujo de

células JURKAT, HSB2, NK-YT o NK-92 incubadas con anti-CD2 PE o anti-2B4 seguido de anti-IgG PE (histogramas sombreados). Los histogramas en blanco representan controles isotípicos y la MFI detectada está indicada en cada histograma. En la figura se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.

Por otro lado, en la Figura 48 se muestran las interacciones de A43-Fc y hCD48-Fc determinadas previamente, y las uniones de atCD48-Fc, hCD48-Fc y hCD58-Fc obtenidas mediante análisis por citometría de flujo de nuevos ensayos de interacción. Para ello se generó la proteína de fusión hCD58-Fc, de la misma forma que las anteriores. Si nos atenemos a las células JURKAT al ser las únicas que expresan solamente hCD2, los resultados indicaron que A43-Fc y atCD48-Fc eran capaces de unirse a hCD2, aunque con menos intensidad que el propio ligando hCD58-Fc. Además, como era de esperar, atCD48-Fc se une intensamente a h2B4, al igual que A43-Fc.

Resultados

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Figura 48. Interacciones de A43, hCD48, atCD48 y hCD58 con células humanas T y NK. Citometría de flujo de

células JURKAT, HSB2, NK-YT o NK-92 incubadas con 8µg/ml de las proteínas de fusión A43-Fc, hCD48-Fc, atCD48- Fc o hCD58-Fc seguido de anti-hFc y anti-IgG PE (histogramas sombreados). Los histogramas en blanco representan controles isotípicos y la MFI detectada está indicada en cada histograma. En la figura se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.

5.9. Generación de una proteína CD48 humana con propiedades de interacción