Plug Flow Reactor Model

Con objeto de determinar la localización celular de los vSLAM identificados, en primer lugar se clonaron los genes correspondientes a estos vSLAM en el vector pDisplay, que permite expresar las proteínas virales fusionadas en su extremo N-terminal al epítopo de 9 aminoácidos de la proteína hemaglutinina A (HA). De esta manera, transfectando transitoriamente células COS-7 con estos plásmidos, HA-S1, HA-A33, HA-A43, HA-A44, HA- A45, HA-S30 o HA-S31, analizamos si estas proteínas virales se expresan en las superficie celular mediante citometría de flujo con un anticuerpo anti-HA. Como se puede observar en la Figura 20, determinamos que S1, A45, S30 y S31 se expresan en elevados niveles en la superficie celular, con un 71-92% de células marcadas con el anticuerpo. Por otro lado, A33 y A43 también son detectadas en la superficie celular pero en pequeñas cantidades (28% y 35%, respectivamente), mientras que A44 prácticamente no se expresa en la membrana de las células transfectadas.

Resultados

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Figura 20. Análisis de la expresión de superficie de los vSLAM a estudio. (A) Citometría de flujo de células COS-7

sin transfectar o transfectadas con los plásmidos HA-S1, HA-A33, HA-A43, HAS-30, HAS-31, HAA-44 o HAA-45 e incubadas con anti-HA, seguido de anti-IgG ratón-PE (histogramas sombreados). Los histogramas en blanco representan controles isotípicos. El porcentaje de células positivas está indicado en cada histograma. En la figura se muestran experimentos representativos de tres ensayos independientes.

Las bajas expresiones en la superficie celular de A33, A43 y A44 podrían ser debidas a que estas proteínas virales fueran procesadas proteolíticamente y liberadas al medio extracelular. Al carecer de anticuerpos específicos frente a estas proteínas virales que permitieran su detección en el sobrenadante de células en cultivo, procedimos a analizar si su expresión en la superficie celular era alterada al promover la acción de proteasas implicadas en la liberación al medio extracelular de los ectodominios de proteínas de superficie. Para ello se transfectaron transitoriamente células COS-7 con los plásmidos HA-A33, HA-A43 y HA-A44 y se trataron con PMA, un agonista de la proteína quinasa C que actúa como inductor de una gran variedad de proteasas. Como se puede observar en la Figura 21, mediante citometría de flujo se detectó una disminución de la expresión en la superficie celular de estas proteínas virales al añadirles a las células PMA. Por otro lado, estas células transfectadas también fueron tratadas con GM6001, un inhibidor de amplio espectro de las metaloproteasas dependientes de zinc. En este caso, observamos que se promovía una acumulación en la membrana celular de las tres proteínas virales. En conjunto, estos resultados indicarían que estas proteínas son secretadas al medio extracelular mediante su procesamiento proteolítico.

Resultados

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Figura 21. Análisis de la expresión en la superficie celular de A33, A43 y A44 tras incubación con PMA o GM6001. Células COS-7 transfectadas con HA-A33, HA-A43 o HA-A44 fueron incubadas sin o con PMA (50 ngr/mL) o

GM6001 (20 µM) durante 24 horas a 37ºC. Tras ello, fueron marcadas con anti-HA seguido de anti-IgG ratón-PE y analizadas por citometría de flujo. En la figura se muestran los porcentajes de células positivas para el anticuerpo anti- HA. Los experimentos son representativos de tres ensayos independientes.

Se ha descrito que la integridad del tallo es necesaria para que tenga lugar la liberación de ciertas proteínas al medio extracelular (Dewitz et al., 2014). Además, algunos estudios proponen que un residuo de lisina presente en la región del tallo podría favorecer el corte proteolítico y secreción de las proteínas (Chen et al., 1995). Tomando como ejemplo A43, para comprobar de una forma más directa el procesamiento proteolítico de esta proteína se estudió la expresión en la superficie de células transfectadas de un mutante del tallo de A43. Este mutante contiene el residuo de lisina presente en el tallo de A43 cambiado por una prolina (HA-A43 K216P). Así, se transfectaron células COS-7 con este plásmido y fueron no incubadas o incubadas con PMA. Como control se emplearon células transfectadas con HA-A43. Al analizar por citometría de flujo la expresión en la superficie celular de A43, detectamos un aumento considerable de la misma en ambas condiciones en el mutante HA-A43 K216P (Figura 22). Por tanto concluimos que este residuo de lisina es crítico para la liberación de A43 al espacio extracelular.

Figura 22. Análisis de la expresión en la superficie celular de A43 K216P. (A) Células COS-7 transfectadas con

HA-A43 o HA-A43 K216P fueron no tratadas (CTL) o tratadas con PMA (50 ngr/mL) durante 24 horas a 37ºC. Tras ello, las células se marcaron con anti-HA seguido de anti-IgG ratón-PE y fueron analizadas por citometría de flujo. En la figura se muestran los porcentajes de células positivas para el anticuerpo anti-HA. Los experimentos son representativos de tres ensayos independientes. Los histogramas en blanco representan controles isotípicos.

A continuación, quisimos determinar el peso molecular y el grado de glicosilación de los cuatro vSLAM identificados que presentan una mayor expresión en membrana celular, S1, A45, S30 y S31. Para ello, los lisados de células COS-7 sin transfectar, COS-7 HA-S1, COS-7 HA- A45, COS-7 HA-S30 y COS-7 HA-S31 previamente biotinadas, fueron inmuonoprecipitados con anti-HA y analizados por WB. Como se muestra en la Figura 23, utilizando estreptavidina-POD

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obtuvimos una banda de entre 61 y 74 kDa para S1, de entre 115 y 141 kDa para A45, de entre 60 y 78 kDa para S30 y dos bandas para S31, una de entre 100 y 132 kDa y otra de alrededor de 70 kDa (Figura 23). Teniendo en cuenta que los pesos moleculares teóricos deducidos de las secuencias aminoacídicas de estas proteínas virales son mucho menores y, en base a los múltiples sitios de N-glicosilación predichos y a los largos tallos con potenciales O- glicosilaciones de S31 y A45, examinamos la posibilidad de que estos vSLAM estuvieran altamente glicosilados. Para ello, se realizó un tratamiento con la enzima N-glicosidasa F, obteniendo una banda de 34 kDa para S1, de entre 80 y 116 kDa para A45, de 31 kDa para S30 y de entre 55 y 86 kDa para S31 (Figura 23). Por lo tanto, teniendo en cuenta este resultado se pudo concluir que S1, A45, S30 y S31 son unas proteínas de superficie celular muy N-glicosiladas.

Figura 23. Determinación de los pesos moleculares y el grado de glicosilación de S1, S30, S31 y A45. Análisis

por WB de extractos biotinados e inmunoprecipitadoscon conjugados anti-HA-agarosa de células COS-7 transfectadas con los plásmidos de expresión indicados. Células sin transfectar (CTL) fueron usadas como controles negativos. Cuando se indica las muestras fueron tratadas con N-glycosidasa F (N-Gly F). Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, transferidas a membranas de nitrocelulosa e incubadas a continuación con estreptavidina-POD. Los pesos moleculares están indicados (kDa).

Además, los pesos moleculares teóricos sugún la secuencia proteica de A45 y S31 son de 46 y 40kDa, respectivamente. Debido a que las diferencias entre estos pesos moleculares predichos y los pesos moleculares observados al eliminar las N-glicosilaciones son de entre 34 y 70 kDa para A45 y de entre 15 y 46 kDa para S31, sugerimos que estas proteínas virales se encuentran muy O-glicosiladas.

En el caso de las proteínas virales A33, A43 y A44 , debido a los resultados previos que indicaban que son procesadas proteolíticamente y secretadas al medio extracelular, para las caracterizaciones bioquímicas de estos vSLAM utilizamos los SN de las células transfectadas. Se realizó una IP con anti-HA de los SN de células COS-7 sin transfectar o transfectadas con HA-A33, HA-A43, HA-A44 y, tras realizar un WB, se empleó un anticuerpo anti-HA seguido de un anti-IgG POD para la detección de estas proteínas. Tal y como se observa en la Figura 24, se obtuvieron dos bandas correspondientes a dos glicoformas de entre 54 y 60 kDa, y de 65 kDa para A33, una banda de entre 47 y 50 kDa para A43, y una banda de entre 68 y 85 kDa para A44. Teniendo en cuenta que los pesos teóricos deducidos a

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partir de las secuencias aminoacídicas de estas proteínas virales son mucho menores que los detectados por WB y, en base a los 12, 7 y 5 sitios de N-glicosilación predichos para A33, A43 y A44 respectivamente, se examinó si estos vSLAM se encontraban altamente glicosilados. Para ello se realizó un tratamiento con la enzima N-glicosidasa F, obteniendo una banda de 23 kDa para A33, una banda de 29 kDa para A43 y una banda de 23 kDa para A44. Por lo tanto, concluimos que A33, A43 y A44 son proteínas altamente glicosiladas que se secretan al medio extracelular.

Figura 24. Determinación de los pesos moleculares y el grado de glicosilación de A33, A43 y A44. Análisis por

WB de sobrenadantes concentrados y sin suero fetal bovino de células COS-7 transfectadas con los plásmidos de expresión indicados. Células sin transfectar (CTL) fueron usadas como controles negativos. Cuando se indica las muestras fueron tratadas con N-glycosidasa F (N-Gly F). Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, transferidas a membranas de nitrocelulosa e incubadas a continuación con un anticuerpo anti-HA seguido de un anti-IgG POD. Los pesos moleculares están indicados (kDa).