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Los microorganismos que habitan el tracto gastrointestinal de vertebrados herbívoros son los principales agentes de la asimilación de hidratos de carbono complejos ingeridos por el animal. La biología y ecología de esta población microbiana es muy similar en la mayoría de las especies animales. La selección de especies y la adaptación de las poblaciones microbianas está determinada más por la dieta y el tiempo de retención que por el huésped, sea éste rumiante o no- rumiante.

Analizaremos en forma sumaria el rol de la microflora en un ambiente muy particular, con muchos caracteres de un sistema de cultivo continuo y conocido como rumen, los principios de la degradación anaerobia por fermentaciones de materiales vegetales, principalmente celulósicos y amiláceos contenidos en la alimentación y el rol de varias especies de bacterias, protozoos y hongos, en este proceso.

Todos los animales herbívoros poseen una porción dilatada en su tubo digestivo donde los alimentos fibrosos voluminosos, que forman gran proporción de su dieta, pueden ser detenidos y sufrir una serie de fermentaciones, que los hacen disponibles para su asimilación.

En los rumiantes, esta porción está representada por el rumen, que es un pre-estómago complejo de tamaño considerable, y en menor grado por el ciego y el colon. Otros herbívoros, como el conejo y el caballo presentan un ciego muy agrandado, donde ocurren los procesos microbianos. El rumen ha sido comparado a un fermentador: su temperatura y estado anaerobio son estables, las fluctuaciones de pH son limitados. Pero se diferencia de un dispositivo industrial en que la composición química y la estructura de los sustratos ingeridos, varían amplia y rápidamente. El rumen, es en esencia, un sistema anaerobio muy reductor en un medio ligeremente ácido, de pH fijo, isotérmico, de una temperatura de unos 39ªC y con una fase gaseosa compuesta principalmente de CO2, metano y nitrógeno. El pH se mantiene relativamente constante (6-7) por la absorción de de los ácidos grasos por la pared del rumen o por neutralización por sistemas tampones de la saliva.

Los microorganismos que colonizan a los jóvenes animales por la ingesta, saliva, aire, heces son

estrictamente anaerobios, aunque algo de 02 es tolerado y si la fermentación es activa el Eh se mantiene en límites normales (-250 a -450mV).

Las enzimas para la fermentación son provistas por un significativo número de especies de bacterias, hongos y protozoos y el número relativo de las distintas especies varía con la composición y estructura del alimento. Por otra parte, las interacciones biológicas que se dan entre ellas son altamente complejas.

La proliferación continua de los microorganismos está asegurada por la ingestión periódica de los alimentos y el flujo continuo de saliva, el paso del contenido a lo largo del tracto digestivo y por la absorción de los productos finales del metabolismo a través de la pared del rumen. La autolisis de microorganismos asegura el desarrollo de otros microorganismos que se nutren de los productos liberados (canibalismo).

En general, los organismos sobreviven en este ecosistema si su tiempo de generación es menor que el tiempo de retención en este órgano. Muchos microorganismos pueden sobrevivir en situaciones de rápido tránsito por adhesión a las paredes o a partículas grandes de alimentos. Generalmente, las especies dominantes en el rumen convierten la energía del sustrato en

biomasa, resultando en menor formación de ácidos por unidad de sustrato. La selección natural también favorece el máximo trabajo bioquímico (Hungate, 1966), en general en relación inversa al tamaño celular.

Si bien la proporción de los productos finales varía, ellos consisten principalmente en: CO2, CH4 y tres ácidos grasos volátiles (AGV): acético, propiónico y butítrico, junto a amonio, trazas de otros ácidos grasos y algunas veces, ácido láctico.

Microorganismos anaerobios con adaptaciones ecológicas y requerimientos nutritivos similares existen en silos, aguas servidas, en la biodegradación anaerobia de restos orgánicos. La diferencia más marcada es que en la biodegradación anaerobia en silos o aguas el tiempo de retención es mayor, con más eficiencia en la extracción de la energía del sustrato y proliferación de bacterias metanogénicas que poseen un tiempo de generación mayor (4 días) que el tiempo de retención de los sustratos. El resultado es que en estos ambientes no se acumulan ácidos grasos y los productos se degradan a CH4 y CO2 (capítulo 8).

Metodología de estudio

Se han empleado numerosas técnicas para estos estudios. Suspensiones lavadas: un gran volumen de contenido ruminal se filtra por tela y luego se centrifuga primero lentamente para eliminar los protozoos grandes y luego a mayor velocidad por 30´ y se incuba con solución de fosfatos para regular el pH, en anaerobiosis con el sustrato a analizar. Se siguen procesos como la decarboxilación del ácido succínico y la reducción de los nitratos. Se aprecia generalmente correlación con los resultados obtenidos in-vivo. Esta técnica constituye un medio útil para estudiar con detalle las propiedades de la flora mixta del rumen luego de la eliminación de complicaciones como la absorción a partículas y la presencia de varios sustratos.

Rumen artificial: existen numerosos dispositivos para realizar los estudios in-vitro que tienden a similar las condiciones físico-químicas y ambientales del rumen natural. Estos se perfeccionan de modo de analizar efectos de poblaciones microbianas, condiciones vinculadas a la nutrición y factores ambientales. Constituyen verdaderos reactores con controles de entrada y salida de metabolitos, regulación de condiciones de incubación, como temperatura, pH, presión osmótica, etc. y permiten estudiar la degradación de diferentes sustancias por poblaciones microbianas solas o asociadas.

Aislamiento y cultivo de bacterias del rumen

La mayor dificultad en estos estudios radica en el mantenimiento de las condiciones de anaerobiosis durante el muestreo, siembra y cultivo de los microorganismos, muchos de los cuales viven asociados entre si lo que dificulta su aislamiento.

Muestro y cultivo

El contenido ruminal se obtiene por succión luego de efectuar una homogeneización manual y después de una agitación suave bajo CO2 y se filtra por gasa y se liberan las células adheridas a las partículas (0,1% de Tween 80, con 6-8 horas a 0º, o 0,1% de metilcelulosa). Se efectúan suspensiones-diluciones decimales en diluyente en anaerobiosis las que se inoculan e incuban en los medios escogidos para efectuar el recuento de bacterias, manteniendo siempre la

anaerobiosis.

Se usan diferentes cámaras de incubación con atmósfera controlada, en general con suficiente CO2, que mantiene el pH a niveles adecuados y es empleado por numerosas bacterias. Una mezcla con 95% de CO2 y 5% de H2 ha sido también empleada.

Stewart y Bryant (1988) resumen la composición de los medios no selectivos más empleados para recuento, aislamiento y mantenimiento de bacterias del rumen. Los recuentos se hacen en tubos con medio sólido, previamente fundido a 45ºC antes de inocular, girado sobre las paredes hasta que el agar solidifica (roll-tubes). Las colonias quedan incluidas en el agar, a lo largo del tubo.

Además de los medios no selectivos, se emplean gran número de medios selectivos, que permiten evaluar grupos particulares, como amilolíticos, pectinolíticos, lipolíticos, metanogénicos.

Población microbiana

El cuadro 1 (van Soest, 1994) presenta los organismos descriptos en el rumen. Las bacterias pequeñas constituyen la mitad de la biomasa en rumen normal, pero son responsables de la mayor actividad metabólica (generalmente en relación inversa al tamaño celular).