Facets of Behavior in Serial Murder

Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que mutaciones en genes de

este operón en K. pneumoniae afectan la expresión de componentes de la matriz

extracelular, específicamente la producción de celulosa y la formación de biopelícula por este patógeno.

Reportes anteriores demostraron que el operón yfiRNB de K. pneumoniae está

implicado en la formación de biopelículas por medio de la expresión de fimbrias tipo 3, siendo éstas reguladas por el segundo mensajero intracelular c-di-GMP

(Wilksch et al., 2011). El gen yfiN codifica para una enzima DGC, la cual modula la

concentración intracelular de c-di-GMP. Esta proteína contiene el dominio de respuesta GGDEF y además el dominio sensor HAMP (Histidine kinases, Adenyl ciclases, Methyl binding proteins, Phosphatases), del cual se ha reportado que sensa y responde a un amplio rango de condiciones medioambientales (Diaz, 2011; Jenal & Malone, 2006). El gen yfiB al parecer codifica una proteína de membrana externa cuya función aún no es clara, pero se presume que tiene efecto en la formación de biopelícula ya que la mutación de este gen disminuye la biopelícula. Se ha sugerido que la proteína YfiB sensa alguna señal externa que

En este estudio, la deleción específica del gen yfiR, el regulador negativo del

operón, aumenta la expresión del gen yfiN y resulta en un fenotipo alterado en los

componentes de la matriz extracelular. El gen yfiR mutado aumenta

específicamente la transcripción del gen yfiN, demostrado previamente que

codifica para una proteína con actividad DGC (Wilksch et al., 2011) y no altero la expresión de otro gen para una DGC, ycdT. Por su parte, el gen yfiB tampoco afecta la expresión de esta DGC, indicando que no juega un papel aparente en la modulación de las concentraciones de c-di-GMP. El efecto sobre la matriz extracelular se evidenció en los ensayos fenotípicos, al crecer células en los medios con rojo congo y calcofluor, así como también por la determinación de azúcares, utilizando antrona y el tratamiento con celulasa. En conjunto, los datos indican que este mutante produce una biopelícula más robusta gracias a un aumento de celulosa en su EPS. Los ensayos de microscopía sustentan este resultado, al mostrar una biopelícula más robusta producida por el mutante yfiR, una más delgada y dispersa por parte del mutante yfiN, ambos diferentes de la cepa silvestre.

El análisis bioinformático de los genomas secuenciados de K. pneumoniae

identificó dos loci con genes para la síntesis de celulosa (ver FIG 6). Dos de esos

genes, identificados aquí como bcsA1 y bcsA2, poseen los dominios de las familia

Glicosiltransferasa 2 de la celulosa sintasa, además del dominio PilZ, característico de varias proteínas efectoras de la red de transducción de señal de c-di-GMP (Ryjenkov et al., 2006). El hecho de que se encuentren dos loci en K. pneumoniae distingue a esta bacteria de otras enterobacterias, como E. coli y Salmonella spp, que sólo tienen un locus con dos operones divergentes. Análisis de las diferentes proteínas codificadas en el operón repetido (operón bcsABCZ) indica que muy probablemente este operón es una duplicación del original. Esta aparente duplicación sugiere que la producción de celulosa puede cumplir una

ambientales. La celulosa microbiana puede cumplir diversas funcionas. En algunas especies, como S. typhimurium, S. enteritidis y E. coli, se sintetiza durante la formación de biopelículas (Solano et al., 2002; Zogaj et al., 2001). En especies de Rhizobium y Agrobacterium facilita la adhesión celular y las interacciones

simbióticas infecciosas mientras que en el caso de A. xylinum y Sarcina ventriculi

puede conferir protección en sus ambientes naturales. (Ross, Mayer, & Benziman,

1991). No se sabe mucho sobre la producción de celulosa y su papel en K.

pneumoniae, sin embargo, la presencia de dos operones putativos con genes para celulosa sintasa indica que este polímero podría ser importante en determinados entornos ambientales y su producción muy probablemente se activa por las condiciones específicas del microambiente en que se encuentre.

De acuerdo a los resultados obtenidos con los diferentes mutantes en la cepa LM21 (FIG 11), el operón yfiRNB no afecta directamente la expresión bcsA, los genes putativos de la celulosa sintasa. Estos resultados difieren un poco de lo obtenido al analizar los mutantes originales por transposición (FIG. 12). Sin embargo, es posible que factores adicionales en la cepa original CG217 puedan ser responsables de la diferencia observada. Habría que realizar análisis más profundos, como análisis de los operones predichos para celulosa en la cepa CG217 y re-estableciendo mutaciones limpias de cada alelo, para poder identificar la naturaleza de estas diferencias. Los resultados con las cepas isogénicas en LM21 permiten, sin embargo, plantear que, al igual a lo que ocurre en otros organismos, la regulación de la producción de celulosa ocurre a través del dominio PilZ y es mediado por un cambio alostérico generado por interacción con el c-di- GMP (Bhowmick et al., 2011; Jenal & Malone, 2006; Raterman et al., 2013; Römling, Galperin, & Gomelsky, 2013; Ryjenkov et al., 2006)

En conjunto, estos resultados indican que la sobre expresión de yfiN, como se ve

en el mutante yfiR, puede aumentar los niveles de c-di-GMP que a su vez

aumenta la producción de celulosa, muy probablemente por regulación alostérica, y genera cambios en la matriz extracelular. En este sentido la producción de EPS

parece estar regulada tanto a nivel transcripcional (expresión de yfiN), como pos- transcripcional (síntesis de celulosa). El segundo mensajero c-di-GMP, ubicuo en bacterias y ausente en eucariotas y Archaeas, tiene efectos antagonistas sobre motilidad y virulencia en células planctónicas, así como adhesión y persistencia en comunidades multicelulares como las biopelículas. Este mensajero intracelular por lo general media la transición entre un estado unicelular y mótil, y otro caracterizado por ser multicelular y adherido a una superficie. (Jenal & Malone, 2006; Römling et al., 2013). A pesar de la existencia de múltiples copias genómicas de genes para DGCs y PDEs, enzimas reguladoras de los niveles celulares de c-di-GMP, no todas actúan de igual forma y por lo general las diferentes copias aquí en el caso de yfiN y ycdT que, aún siendo los dos genes para DGCs, tienen fenotipos contrastantes en cuanto al desarrollo de la

biopelícula. En el caso específico de yfiN, se afecta la matriz extracelular tanto por

producción de celulosa como por producción de pili tipo 3, tal como lo observamos en los ensayos de hemaglutinación para determinación de fimbrias (Datos no mostrados) (Wilksch et al., 2011).

Finalmente, las observaciones de la estructura tridimensional de la biopelícula, mediante microscopia confocal, permitieron caracterizar las biopelículas cuantitativamente y/o semi-cuantivamente y nos confirma una vez más de manera indirecta el efecto de los cambios a nivel de la matriz extracelular. Estas imágenes corroboran el fenotipo observado en la cuantificación de la biopelícula mediante cristal violeta, donde el mutante _∆yfiR muestra robustez en su biopelícula. Esto

coincide con la hipótesis expuesta previamente postulando que _∆yfiR

sobreexpresa tanto la producción de fimbrias tipo 3 (Wilksch et al., 2011) como componentes asociados a la matriz extracelular (Malone et al., 2010).

6.2 El gen ycdT y su función en la formación de biopelícula de K. pneumoniae

Los resultados obtenidos con el mutante ycdT en este trabajo muestran que este

gen también afecta la biopelícula en K. pneumoniae, aunque su fenotipo no es tan

evidente como lo observado para el mutante en yfiR y en este caso se observa sólo al comparar crecimiento sobre diferentes superficies. Este fenotipo es probablemente debido a cambios en componentes celulares tales como adhesinas que pueden cambiar las propiedades electrostáticas de la superficie celular, mostrando mayor afinidad por superficies hidrofóbicas.

El mutante M14 se identificó porque originalmente producía una biopelícula menos robusta que la cepa parental (ver FIG 4) y contenía una inserción que afectaba otro gen codificante para una proteína DGC. Aunque la predicción de la inserción original varió dependiendo del genoma analizado (ver sección 5.2.3), la reconstrucción del mutante en la cepa LM21 permitió verificar el fenotipo original, indicando que este gen afecta la formación de biopelícula. La proteína YcdT ha

sido reportada en E. coli como una DGC activa que a su vez es regulada por CsrA,

una proteína de unión a RNA que controla el metabolismo del carbono, la formación de biopelícula y la motilidad (Jonas et al., 2008). Sin embargo, la función de este gen, tanto en E. coli como en otras enterobacterias, incluida K. pneumoniae permanece aún desconocida ya que no se conoce con certeza su mecanismo de acción. La medida de la concentración de c-di-GMP por HPLC mostró diferencias en comparación con la cepa parental, indicando que YcdT produce una DGC activa (ver FIG 13), lo cual está de acuerdo con análisis hechos para confirmar la actividad de otros genes para DGC (Spangler et al., 2010).

Ensayos en medios indicadores no mostraron fenotipos distintivos con respecto a la cepa parental (Tabla 4). Sin embargo, se observó que la formación de biopelícula variaba dependiendo de la superficie sobre la cual se produce la

biopelícula, PVC, poliestireno o borosilicato, y se observaron cambios en la estructura de las biopelículas por microscopía confocal y electrónica (ver FIG18 y 19). En este estudio se ensayaron al menos dos diferentes medios de cultivo, y no se observaron diferencias respecto al fenotipo de biopelícula (datos no

mostrados). En particular, el fenotipo del mutante en ycdT varía dependiendo de si

la superficie es hidrofóbica o hidrofílica, mostrando disminución y aumento de la formación de biopelícula, respectivamente.

Las observaciones de microscopía, y en particular aquellas de microscopía

electrónica, indican que quizás el gen ycdT afecte la etapa inicial de la formación

de biopelícula. La distribución de la estructura de la biopelícula indica que ycdT puede estar afectando componentes de la pared celular como proteínas de adhesión, que afectan las uniones célula – célula. Estas observaciones microscópicas, junto con la ausencia de cambios evidentes a nivel de matriz extracelular al crecer en medios indicadores, y el efecto de la superficie sobre la formación de biopelícula, sugieren que el gen afecta propiedades celulares que alteran la adhesión bacteriana en la etapa inicial de la formación de biopelícula. Este fenotipo estaría mediado por c-di-GMP producido por YcdT, que se muestra aquí que es una DGC activa.

Las biopelículas no son simples acúmulos bacterianos adheridos a una superficie, sino que se muestran como sistemas biológicos complejos que requieren señales célula-célula y cierto grado de especialización celular. En dicho sistema la capacidad de adhesión inicial implica mecanismos de diferente naturaleza, los que establecen uniones de carácter físico-químico que acercan al microorganismo a la superficie (biótica o abiótica) y otros de naturaleza especifica que implican la presencia de adhesinas y receptores del sustrato. En este sentido se dice que la unión de las bacterias a un polímero es el paso inicial para la formación de

biopelículas en donde la hidrofobicidad de la superficie celular modula en gran medida las propiedades de fijación del organismo (Tribedi & Sil, 2013). Los componentes que influyen en las propiedades de la superficie bacteriana de bacterias Gram-negativas incluyen proteínas de la membrana externa, los polisacaridos capsulares (ácidos), el LPS (Antigeno O) y las fimbrias (Williams, Lambert, Haigh, & Brown, 1986).

La hidrofobicidad es una propiedad de las superficies que está relacionada con la forma en la que estas interactúan con el sustrato. Esta propiedad depende de las distribuciones superficiales de carga eléctrica. En este sentido, la distribución de carga superficial bacteriana determina la afinidad por las superficies a las cuales se puede fijar. De acuerdo al fenotipo de biopelícula observado para el mutante

en ycdT, podemos inferir que se está afectando la distribución electrostática de la

superficie bacteriana, permitiendo que las células se comporten de manera diferente a la cepa silvestre. Esto se refleja en una disminución de la adhesión a superficies hidrofílicas (PS y borosilicato) y un aumento en PVC, permitiéndonos concluir que se está afectando la hidrofobicidad de la superficie bacteriana lo cual desempeña un papel importante en la unión no específica a las superficies bióticas o abióticas sobre la cual se va a desarollar la biopelícula.

Nosotros proponemos, por consiguiente, que la deleción de ycdT puede afectar la

composición de la superficie celular, lo que puede influir en diferentes factores como la expresión de fimbrias y/o adhesinas especificas, que afectan el contacto (adhesión) célula-célula o con la superficie. Muchas estructuras bacterianas extracelulares han sido descritas como esenciales para la interacción con superficies inertes en la primera etapa de adhesión, tales como la fimbria agregativa (SEF17) en S. enteritidis, el pili tipo IV en P. aeruginosa, la autolisina (AtlE) en S. epidermidis y el pili tipo 1 y la fimbria curli en E. coli (Diaz, 2011). En

K. pneumoniae se ha mostrado que la expresión de pili tipo 1 no favorece la adherencia bacteriana ni la formación de biopelícula sobre superficies abióticas tanto hidrofóbicas como hidrofílicas(Di Martino et al., 2003; Suescún et al., 2006).

En el caso del mutante en ycdT, la superficie bacteriana podría tener un carácter

hidrofílico y por tanto su adhesión inicial se ve disminuida sobre superficies hidrofílicas (vidrio y Poliestireno) ya que se repelen al estar en igualdad de condiciones. Esto estaría de acuerdo con lo reportado por Martino P y

colaboradores, donde ellos en un estudio de 37 cepas de K. pneumoniae,

incluyendo aislamientos clínicos, cepas ambientales y la cepa ATCC, encontraron un alto porcentaje de cepas con alta hidrofobicidad correspondiente al 42,4% de las cepas analizadas (Di Martino et al., 2003). Nuestra cepa LM21 no estaría aparentemente dentro del porcentaje de cepas con mayor hidrofobicidad, lo cual se ve en el ensayo de MATH donde encontramos que tanto la cepa silvestre como

el mutante ycdT tienen un porcentaje bajo de hidrofobicidad respecto a P.

aeruginosa usada como control. En otro estudio también demostraron que las

cepas capsuladas de K. pneumoniae son de carácter hidrofílico y que la deleción

de antígeno capsular y el LPS afectan las propiedades físico-químicas superficiales debido a la presencia o ausencia de componentes principales de la

superficie celular, similar a lo que ocurre con la mutación en el gen ycdT.

Diferentes estudios han mostrado que en bacterias Gram negativas, la producción de algunos factores de adhesión y de EPS es promovida por la actividad de enzimas DGCs, que controla los niveles intracelulares de c-di-GMP. Esto se ha

demostrado con la producción de celulosa en S. typhimurium y S. enteritidis donde

la concentración de c-di-GMP media la producción del polisacárido dependiendo de interacciones especificas entre las DGCs y proteínas blanco especificas (Zogaj et al., 2001). Además, se ha reportado que el c-di-GMP puede regular la expresión

génica a través de la unión directa a riboswitch en mRNAs evitando la unión del c- di-GMP a proteínas reguladoras (Tagliabue et al., 2010). Hinnebusch B y

colaboradores, recientemente han confirmado que en Y. pestis únicamente tres

proteínas regulan los niveles de c-di-GMP y la formación de biopelícula, dos DGCs (HmsT y Y3730) y la PDA HmsP. También reportan un segundo fenotipo de autoagregación dependiente de c-di-GMP. Este fenotipo es independiente del control de la producción de EPS (PNAG) por c-di-GMP y sugiere que la regulación de los componentes de la matriz no necesariamente están implicados en la biopelícula (Sun et al., 2011).

En términos generales la adhesión bacteriana esta mediada por factores propios del microorganismo y por características de la superficie a cúal se fija. Razón por la cual se hace más difícil encontrar la verdadera razón en cuanto a la afinidad del mutante en ycdT por otra superficie, lo que justifica la disparidad en los estudios de adhesión bacteriana y la dificultad para dilucidar la verdadera influencia del material.

6.3 Modelo de virulencia en C. elegans y resistencia a antibióticos de