The Cognitive Element

Las cepas parentales junto con las mutantes generadas fueron evaluadas y caracterizadas por electroforesis en campo pulsado (PFGE), confirmando que no hubo ningún cambio genético en su ambiente genético (Figura 17). Además, teniendo en cuenta el ambiente genético, fueron secuenciados los marcos de lectura abiertos de gdpD y cls en su totalidad en los dos sentidos, evidenciando que fueron los correctos.

Con el fin de evaluar si los efectos eran debido a las mutaciones por la deleción y no a otros efectos, se realizaron las complementaciones in cis en cada uno de los ambientes genéticos, el gen liaR fue amplificado por PCR con los iniciadores 1 y 4 para E. faecalis y

11 y 12 para E. faecium (Tabla 7) utilizando ADN de los mismos como templado; los fragmentos obtenidos de 2113 y 1944 pb fueron clonados en pHOU3 y pHOU1, respectivamente. Los plásmidos recombinantes se entregaron en las mutantes con la deleción de E. faecalis S613F_ΔliaF177gdpD170cls61ΔliaR, E. faecalis OG1RFΔliaR y E. faecium R497FΔliaR utilizando los mismos procedimientos especificados anteriormente. El gen liaR también fue clonado en el plásmido pAT392 (Arthur, 1994). La complementación in trans en E. faecalis OG1RF, se amplificó el gen liaR por PCR con los iniciadores 9 y 10 (incluyendo el sitio de unión ribosomal y el codón de parada de liaR) (Tabla 7) utilizando ADN total de E. faecalis OG1RF como templado. El fragmento de ADN resultante (664 pb) se clonó posteriormente en el plásmido pAT392 (Arthur, 1994) bajo el control del promotor

Figura 17. Electroforesis en campo pulsado de las cepas parentales, mutantes por deleción de liaR y complementaciones para E. faecalis y E. faecium. A. PFGE E. faecalis, línea 1: Efs S613; línea 2: Efs S613F; línea 3: Efs OG1RF; línea 4: Efs OG1RFliaR; línea 5: Efs OG1RFliaR::liaR; línea 6: Efs S613F_ΔliaF177gdpD170cls61; línea 7: Efs S613FΔliaF177gdpD170cls61liaR; línea 8: Efs S613FΔliaF177gdpD170cls61liaR::liaR; línea 9: Efs

OG1RFliaR::pAT392liaR. B. PFGE E. faecium R497, línea 1: Efm R497; línea 2: Efm R497F; línea 3: Efm R497FliaR; línea 4: Efm R497FliaR::liaR; línea 5: Efm R497F.

P2 (que permite la expresión constitutiva de los genes clonados) y corriente arriba del gen aac (6')-aph (2") que confiere resistencia a la gentamicina (el cual se co-transcribe a partir del mismo promotor) utilizando los sitios de restricción KpnI y BamHI (pAT392::liaR). Las cepas complementadas fueron evaluadas por réplica en placa en presencia de diferentes concentraciones de DAP y se caracterizaron mediante PCR, confirmando que el gen liaR estuvo presente en su totalidad en todas las complementaciones. Además, se secuenció en su totalidad. Igualmente, se realizo electroforesis en gel de campo pulsado para evidenciar que los ambientes genéticos no presentaran cambio alguno en su perfil de bandas (Figura 17).

Finalmente, se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las cepas obtenidas, determinando su comportamiento en comparación con sus cepas parentales. Se utilizó una densidad óptica de 600nm. A cada cultivo bacteriano se les realizó mediciones cada hora y al mismo tiempo se realizó el recuento de colonias de cada cepa. Como se observa en la Figura 18, las mutantes no presentaron defectos en el crecimiento cuando se comparó con su respectiva cepa isogénica en los tres casos, por lo tanto, podemos resaltar que la deleción de liaR no afectó el crecimiento de las mutantes (Figura 18).

5.1.3 Búsqueda de la localización de microdominios de cardiolipina en la membrana celular de la cepa mutante E. faecalis S613F_∆liaF177gdpD170cls61∆liaR.

Anteriormente, se había demostrado que la aparición de la resistencia a DAP en E. faecalis S613 se asoció con una importante redistribución de microdominios de

cardiolipina en la membrana celular donde se relocalizan lejos del principal blanco de la daptomicina, el tabique o septo (Tran, 2013). Se observó una remodelación de los

Figura 18. Curvas de crecimiento para los aislamientos de E. faecalis

S613F_ΔliaF177gdpD170cls61, E. faecalis OG1RF y E. faecium R497F junto con sus

derivados.

fosfolípidos en la membrana celular después de generar una deleción de la Ile177 en LiaF, lo que sugiere que esta mutación puede producir un efecto en la membrana celular a través de su regulador de respuesta, LiaR. Por lo tanto, con el fin de adquirir más conocimiento sobre el mecanismo de adaptación de la membrana celular y el efecto en la susceptibilidad a la daptomicina mediada por LiaR, se utilizó el colorante fluorescente hidrófobo, 10-N-nonil-naranja de acridina (NAO), para evaluar la localización de los microdominios de cardiolipina enriquecidos en la MC utilizando microscopía de fluorescencia, como se describió anteriormente (Mileykovskaya, 2001; Petit, 1992). Como

se muestra en la Figura 19, la tinción de NAO (500 nm) de la cepa resistente a daptomicina S613F_ΔliaF177gdpD170cls61 reveló la presencia de microdominios de cardiolipina que se localizan lejos del principal tabique de división como se había informado anteriormente (Tran, 2013).

Figura 19. Tinción de células representativas de E. faecalis S613F y derivados con

naranja de acridina 10-N-nonil (NAO) (500 nM). (A-D; I-K) son imágenes que capturaron células bacterianas bajo microscopía de fluorescencia (barra representa 1 m). (E-H) son imágenes de contraste de fase de las mismas células en A-D. (A) S613F muestra microdominios de CL en el tabique y los polos de la célula (flechas blancas). (B, I) S613F_ΔliaF177gdpD170cls61 exhibe microdominios de CL situados fuera del tabique principal y distribuidas a lo largo de las células. (C, J) La deleción de liaR redistribuye los microdominios de CL, "devolviéndolos" hacia el tabique y los polos como se muestra en E. faecalis S613F susceptible a DAP. (D, K) La reintroducción de liaR en su localización cromosómica nativa restauró la remodelación de los microdominios de CL en la MC. Las flechas blancas indican los dominios de CL en la MC.

La deleción de liaR produjo un cambio marcado en la distribución de los microdominios de cardiolipina en ausencia de liaR, estos microdominios de CL fueron redirigidos de vuelta al tabique de la división celular, un patrón similar al observado en la cepa parental E. faecalis S613F (Figura 19). El patrón de distribución de los microdominios de CL en la MC fue totalmente restaurado después con la complementación del gen liaR en el ambiente genético Efs S613F. Este hallazgo proporciona evidencia de que liaR media la redistribución de fosfolípidos en la MC y que este fenómeno estructural puede estar mecánicamente asociado con una amplia gama de resistencias a antibióticos y péptidos antimicrobianos.

5.2 CAPITULO II. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A