FECHA
INGRESO S EDAD SINTOMAS PRINCIPALES
INFANTIL
1 04/2012 M 3 m Retraso madurativo, opistótonos
2 09/2012 F 1 a 1 m Hipotonía, pérdida de habilidades motoras adquiridas
3 12/2012 F 8 m Síndrome convulsivo, retraso psicomadurativo 4 06/2013 M 8 m S/D
5 06/2013 F 1 a 2 m Encefalopatía progresiva
6 09/2013 M 1 a 5 m Síndrome convulsivo, retraso psicomadurativo 7 03/2014 M 1 a 2 m Hipotonía, convulsiones, broncoespasmos 8 08/2014 M 1 a 2 m Retraso madurativo, hipotonía, lesiones sust.
blanca
9 09/2014 M 5 m Convulsiones, retraso psicomadurativo, hipertonía 10 10/2014 F 10 m Hipotonía, pérdida de habilidades motoras
adquiridas
11 06/2015 F 26 d Convulsiones, cianosis, apneas, reflujo gástrico 12 05/2016 M 1 a 3 m Hemiparesia, hipotonía, hemorragia central arterial 13 05/2016 M 2 a Encefalopatía severa, retraso psicomotor
14 07/2016 M 2 a 9 m Encefalopatía progresiva 15 07/2016 F 9 m Hipotonía axial
16 08/2016 F 1 a Fallo de medro 17 09/2016 F 9 m Hipotonía axial
18 11/2016 M 1 a 3 m Microcefalia, síndrome convulsivo
19 11/2016 M 1 a 5 m Hipotonía, dismorfia, dificultad para deglutir 20 12/2016 M 9 m Retraso psicomotor
JUVENIL
1 04/2012 M 14 a Atrofia muscular, movimientos coreoatetósicos 2 06/2012 M 8 a Ataxia, hipotonía perinatal
3 08/2012 M 16 a Ataxia, distonía
4 09/2012 M 18 a Neurodegeneración progresiva 5 09/2012 F 4 a Distonía, Síndrome de Tourette 6 06/2014 M 7 a S/D
7 07/2014 M 18 a Neuromiopatía
8 07/2015 M 5 a 7 m Ataxia, Trastorno del habla, retraso global desarrollo
9 07/2016 F 18 a Síndrome parkinsoniano
ADULTO
1 04/2014 F 29 a Trastorno de la marcha, miopatía, atrofia muscular 2 09/2014 F 39 a Disfagia, trastorno de la marcha, Síndrome
depresivo
3 10/2014 M 27 a Enfermedad de la motoneurona 4 02/2015 M 51 a Enfermedad de la motoneurona 5 11/2016 M 38 a Ataxia, Regresión psicomadurativa TOTAL 34
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En todos los pacientes diagnosticados con ES, y siempre que fue posible, también se incluyó el análisis de los padres y en algunos casos a otros familiares.
Estrategia diagnóstica 2.3.2
Para el diagnóstico de la ES se siguió un algoritmo de trabajo que incluyó en primer instancia el análisis bioquímico y en segunda, el estudio a nivel molecular (Fig. 16).
El estudio bioquímico consistió en la determinación de la actividad Hex en plasma en los pacientes con sospecha clínica de Gangliosidosis GM2. Aquellos con valores de actividad residuales o nulos fueron confirmados como enfermos, mientras que los valores normales, descartaron la patología (Ver apartado 2.3.2.1).
En los pacientes confirmados con ES, se procedió con la investigación a nivel molecular, que comprendió 3 etapas diferentes. En primer lugar, se analizó la mutación más frecuente, c.445+1G>A, utilizando técnicas de restricción enzimática. Los resultados posibles fueron: Paciente homocigota mutado (A/A), heterocigota o portador (G/A) y no portador (G/G). El genotipo se consideró completo únicamente en los pacientes que resultaron homocigotas (Ver apartado 2.3.2.3).
Cuando los pacientes resultaron heterocigotas o no portadores de la mutación c.445+1G>A, se procedió con la segunda etapa (Ver apartados 2.3.2.5, 2.3.2.6 y 2.3.2.7). Ésta consistió en la amplificación por PCR y secuenciación de los exones 7, 8, 10, 12 y 13 del gen HEXB, donde se encuentran las 6 mutaciones: c.782_785delCTTT (p.Ser261Cysfs*13), c.1082+5G>A, c.1242+1G>A, c.1451G>A (p.Gly484Glu), c.1597C>T (p.Arg533Cys) y c.1601G>A (p.Cys534Tyr). Estas mutaciones fueron identificadas previamente en pacientes argentinos diagnosticados en CEMECO entre los años 1970-2010 (Zampieri et al., 2012).
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Por último, en aquellos pacientes que luego de la segunda etapa continuaron con genotipo incompleto o desconocido, se investigaron los restantes exones del gen HEXB por amplificación por PCR y secuenciación.
En aquellos casos que se identificaron variantes con efecto desconocido, se realizó un análisis bioinformático con el objetivo de predecir su posible impacto. Siempre que fue posible, las mutaciones identificadas en los pacientes se corroboraron en los padres y en algunos casos, se investigaron a otros familiares con el fin de detectar portadores.
2.3.2.1 Determinación de la actividad Hexosaminidasa
Se midieron tanto la actividad de Hex parcial (Hex B) como de Hex total (Hex A + Hex B) en plasma sanguíneo según el método fluorogénico con inactivación térmica (O’Brien et al., 1970).
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Para obtener el plasma se partió de 3ml de sangre entera heparinizada y se separó por centrifugación a 2000 xg. Se conservó a -20ºC hasta su utilización.
Para realizar la determinación enzimática, el plasma se descongeló y se diluyó en proporción 1/10 con búfer fosfato-citrato (pH 4,4). Se colocó 50l de plasma diluido en 4 tubos Eppendorf de 1,5ml. Para medir la Hex parcial (Hex B) se tomó dos de los tubos y se incubaron a 60°C durante 2’30’’, la Hex A es lábil a la temperatura y se desnaturaliza. Luego se agregó en todos los tubos 100l de solución 1mM de sustrato artificial (4-metilumbeliferil-N-acetil--D- glucosaminide) y se incubó a 37°C durante 1 hr. Finalizada la incubación se agregó 1,35ml de búfer de parada (0,2 M Carbonato - Glicina, pH 10,5).
Se preparó una curva de calibración con 4-metilumbelliferona en el rango de 0,5-10 nmol. Los valores de actividad enzimática se detectaron en un espectrofluorómetro LS 50 B Perkin Elmer con longitudes onda de excitación de 365 nm y de emisión de 450 nm. Los resultados se expresaron en nmol/ml de plasma/hr.
Los ensayos se realizaron por duplicado y se incluyó un blanco de reacción por cada muestra. Los valores tomados como referencia para la actividad de las Hex fueron tomados de Oller Ramírez, AM, tesis doctoral, 1996 (Tabla 10).
Tabla 10. Valores de referencia para la actividad Hexosaminidasa
VALOR HEXOSAMINIDASA*
PARCIAL (B) TOTAL (A+B)
NORMAL 140-600 400-1150
PORTADOR 50-200 200-590
ZONA GRIS 140-200 400-590
* Valores expresados en nmol/ml de plasma/hr
2.3.2.2 Extracción de ADN
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2.3.2.3 Estudio de la mutación más frecuente c.445+1G>A
Se amplificó por PCR siguiendo el protocolo detallado en apartado 3.2.2.3. Los cebadores utilizados para la reacción se detallan en Tabla 11. El cebador HEXB-RFLP-2R presenta un sitio de apareamiento erróneo (en inglés,
mismatch), diseñado especialmente para generar un sitio de restricción para la
enzima MAEIII (Brown et al., 1992).
Tabla 11. Cebadores utilizados para análisis de la mutación c.445+1G>A
A continuación, se preparó una mezcla de reacción para la enzima MAE II de acuerdo al protocolo del fabricante (Roche). Se agregó cantidad necesaria de producto de PCR y se incubó a 55°C durante 1 hr. Los productos obtenidos se separaron por electroforesis a 35mA durante 1 hr en gel de acrilamida al 8%. El gel se tiñó con una solución de Bromuro de Etidio 0,5mg/ml y los productos se visualizaron utilizando un transiluminador UV (UVP).
2.3.2.4 Diseño de cebadores
Para el diseño de cebadores se utilizó el software PRIMER 3 (Untergasser et al., 2012). Las secuencias de nucleótidos obtenidas permitieron posteriormente la amplificación de cada uno de los 14 exones junto a secuencias intrónicas adyacentes y las regiones no traducidas UTR 5’ y 3’ del gen HEXB (Tabla 12).
2.3.2.5 Amplificación génica
Se amplificaron todos los exones y regiones flanqueantes del gen HEXB siguiendo el protocolo de PCR detallado en apartado 3.2.2.3. Los cebadores utilizados se encuentran listados en la Tabla 12.
CEBADOR REGION SECUENCIA (5’ – 3’) PRODUCTO TAMAÑO
HEXB-RFLP-2F
EXÓN 2 AGGAGTTAACTACAATGTTACTAG 263 pb
HEXB-RFLP-2R ATAATACACTCACATTGCATAGGTAGTTA
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Tabla 12. Secuencia de los cebadores utilizados en la amplificación del gen HEXB
CEBADOR REGION SECUENCIA (5’ – 3’) TAMAÑO
PRODUCTO
HEXB_U5'-1F
UTR 5’ - EXÓN 1 TCTTACTTTAGCCATCCCGTGT 810
HEXB_U5'-1R TTCCACTTACTATCCGGCTCTC HEXB_2F EXÓN 2 GGACTTACAATGGGCAGCAT 350 HEXB_2R TGGTTCCTAGCATGGAGTCAG HEXB_3F EXÓN 3 AGTTAGAGAAATAGGTCATGTGCTTG 327 HEXB_3R TGGAACTACATAACAAAGCATTCTG HEXB_4-5F EXONES 4 y 5 AGATGAGTAGAGAAGTGCAATGGAT 741 HEXB_4-5R CAAATTCCCCTGTTCCAAACTA HEXB_6F EXÓN 6 GAAGCAATTCCAAATGTAGATAGGTA 347 HEXB_6R TTATGGATGTAAAATGCTAAGTCACA HEXB_7F EXÓN 7 TTTCTACTCCTGAAACTATGGCACT 421 HEXB_7R CAGTGAGCCGAGATTGTACTACTG HEXB_8F EXÓN 8 TCAGGAAACCCTTCTTATCTGG 382 HEXB_8R TTTTAAAGGGGTTTTAAGGAATCAT HEXB_9F EXÓN 9 GCAAATAGCTTTAGATGGAGGAGA 564 HEXB_9R TTTAGAACAGATGACTGCCTTCC HEXB_10-11F EXONES 10 y 11 CACCTCTCAAAATGCAAGAAATC 887 HEXB_10-11R GGAGGTTAGGGAAGAAAACTCATAA HEXB_12-13F EXONES 12 y 13 AGGATAAAGATGGAGGAAACAAATC 666 HEXB_12-13R CAGCATTACTGAAAATAAGGGAAGA HEXB_14-U3’F