The hostid of this system does not match the hostid

Para valorar la posible existencia de alteraciones en la metilación global del DNA genómico en pacientes con trastornos del neurodesarrollo de causa desconocida, en primer lugar se evaluaron diferentes técnicas en muestras control seleccionadas de los 36 controles positivos disponibles con mutaciones o cambios de dosis que afectaban a genes de la maquinaria epigenética (anexo II), comparando el resultado con muestras de controles sanos.

Primero se intentó aplicar la técnica de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas). Para ello se adquirió el kit comercial Imprint® Methylated DNA Quantification Kit (Sigma) que contiene todos los reactivos necesarios: placa donde se realiza la reacción de ELISA, anticuerpos de captura de DNA metilado y detección, las distintas soluciones (para la unión del DNA, de lavado, de bloqueo, de revelado y de parada de la reacción) e incluso una muestra de DNA control de metilación (50 ng/μl); y se siguió el protocolo especificado por la casa comercial (figura 86).

Figura 86: Esquema del protocolo utilizado en el Kit de cuantificación de DNA metilado aplicando la técnica de ELISA. Imagen modificada de la página web de la casa comercial SIGMA (http://www.sigmaaldrich.com/).

Esta técnica permite determinar niveles relativos de metilación respecto a una muestra de referencia, que en nuestro caso fue el DNA control proporcionado por la casa comercial. La determinación de los niveles de metilación de las muestras se realiza por colorimetría, siendo la cantidad de DNA metilado proporcional a la absorbancia obtenida. Se realizaron varios intentos para poner la técnica a punto, incluyendo blancos y la curva estándar de la muestra control. Los resultados que obtuvimos presentaban varios inconvenientes:

- Curva de calibración:

Por un lado, para valores por debajo de 50 ng del DNA control no se encontraba una buena correlación con la DO (densidad óptica). Además el valor de la constante de la ecuación de la recta de regresión obtenida daba un valor de DO muy superior al obtenido en los blancos. Por otro lado, la pendiente de la curva tiene un valor muy bajo, lo que nos indica que variaciones significativas de la cantidad de DNA de partida no afectaban al valor de DO obtenido en el rango de ~50-200 ng, y por ende, a la cantidad de DNA metilado estimada por esta técnica (figura 87).

DNA genómico

Union del DNA a la placa Añadir solución de bloqueo

Lavado

Añadir anticuerpo de captura

Lavado

Añadir anticuerpo de detección

Lavado

Añadir solución de revelado Medir absorvancia

y = 0,0017x + 0,4752 R2 _{= 0,9849} 0,080 0,280 0,480 0,680 0,880 0 50 100 150 200 DNA(ng) DO

Figura 87: Curva de calibración estándar del ELISA para la cuantificación de DNA metilado. Los valores de la DO de las distintas diluciones de la muestra control representados han sido corregidos restándose el valor promedio de la DO de los blancos, considerado ruido de fondo.

- Valores de absorbancia:

La dispersión de los valores de DO obtenidos, tanto en las muestras problema como en la muestra control, fue muy amplia, obteniéndose resultados incoherentes. Por ejemplo, se obtuvo algún valor de porcentaje de metilación relativo al DNA control ampliamente superior al 100 %. Además, tras determinar el porcentaje de citosinas metiladas en algunas de esas mismas muestras por HPLC, el método de referencia, se observó una clara ausencia de correlación entre los valores obtenidos por las dos técnicas (figura 88).

Figura 88:Representación de la falta de correlación entre los resultados obtenidos por la técnica ELISA frente al HPLC en la cuantificación de DNA metilado. Ejemplo de los valores obtenidos por las dos técnicas en cuatro muestras distintas.

En base a todo eso y tras ponernos en contacto con la casa comercial, sin llegar ninguna solución, y averiguar además que otros grupos habían tenido problemas similares con la aplicación de la técnica ELISA, decidimos descartar esta estrategia para la determinación de los niveles de metilación.

Posteriormente, se intentó diseñar un nuevo método para la determinación de DNA metilado centrado en las secuencias Alu basado en la digestión con enzima de restricción y PCR cuantitativa, sin éxito.

Tabla 50: Pacientes con alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética seleccionados como controles positivos para el estudio preliminar de metilación generalizada por HPLC.

Muestra Genero Edad Gen Alteración genética _Metilada % C Desviación _estándar CGM478 Mujer 0.1 CHD7 Mutación c.4877delC p.S1626fs dn 3.927 0.079 XF2463 1.7 HDAC4 Duplicación arr 2p25.3(1-2,325,614)x1, 2q37(230,994,184-243,199,373)x3 dn 5.400 0.157 CGM12581 ₂ MECP2 Mutación c.1357C>T p.R453X 4.934 0.047 EX6551 _6.9 MECP2 Mutación c.904c>T p.P302S 2.595 0.057

EX7131 26 MECP2 Mutación

c.1163_1206del44 p.P388fs 4.827 0.050 CGM1397 11 EHMT1 Deleción arr 9q34.3(139,999,668-141,213,431)x1 dn 5.711 0.012 XF20191 Varón 1.9 CHD7 Duplicación 46,XY,t(4;7)(q11;q21).arr 8q12(59,373,672-62,371,000)x3. Ish der(4)t(4;7;8)(4pter-q11::8q12::7q21-7qter)(wcp8+) der(7)(7pter- 7q21::4p11-4pter) 3.900 0.130 CGM2143 2.7 HDAC4 Deleción arr 2q37.3(238,619,349-243,199,373)x1 dn 5.383 0.130 X841 6 MECP2 Duplicación arr Xq28(152,654,501-153,780,138)x3 mat 4.062 0.050 CGM1388 4 EHMT1 Deleción arr 9q34.3(139,794,076-141,213,431)x1 dn 5.794 0.111 XF2761 6.2 HUWE1 Duplicación arr Xp11.22(53,221,610-54,223,027)x3 mat 4.478 0.059 EX1551 ₉

ATRX Mutación (Lossi et al., 1999)

c.5459G>A p.R1742K mat 3.604 0.032

XF1702 2 ATRX Duplicación

Muestra Genero Edad Gen Alteración genética _Metilada % C Desviación _estándar CGM858 Varón 4 RPS6KA3 Mutación c.407 C>T p.A136V 4.698 0.035 EX4111 ₂₈

RPS6KA3 Inserción (Martínez-Garay et al., 2003)

c.244-8ins2800pb(LINE1) p.K81fs 3.704 0.046

EX1251 ₂₃

RPS6KA3 Duplicación (Madrigal et al., 2007)

arr Xp22.12(19,761,845-20,893,188)x3 mat 3.910 0.046 EX1241 26 RPS6KA3 Duplicación (Madrigal et al., 2007)

arr Xp22.12(19,761,845-20,893,188)x3 mat 3.395 0.135

1_{Pacientes que no pertenecen a la serie estudiada en el presente trabajo.}

Figura 89: Distribución de género y edad en los individuos analizados por HPLC. Representación del número de muestras en función del género y la edad, en pacientes con alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética frente a los individuos sanos seleccionados como controles. Por cada paciente se intentó seleccionar uno o dos controles de su mismo género y edad cercana, teniendo en cuenta que la edad máxima de nuestro grupo control era de 18 años.

Finalmente, dado los fracasos previos, nos pusimos en contacto con el grupo del IDIBELL del Dr. Esteller, para realizar como colaboración la determinación de los niveles de metilación generalizada en el genoma mediante la técnica HPLC (apartado 14 de material y métodos).

Inicialmente se realizó un estudio caso-control en una selección de casos formada por 17 muestras de pacientes con alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética (tabla 50) y 33 individuos control, de forma que la distribución por género y edad en los dos grupos fuera lo más parecida posible (figura 89). En los 17 pacientes se obtuvo un valor promedio de 4.472 % de citosinas metiladas (IC 95 % 3.990-4.954 %), mientras que en el grupo control la media fue de 5.121 % (IC 95 % 4.688-5.552 %). El diagrama de cajas de ambas poblaciones y el grafico Q-Q Normal se encuentran representados en la figura 90, además, el test de Shapiro-Wilk nos confirma que ambas distribuciones pueden considerarse normales (valor p de 0.423 para el grupo de pacientes y 0.197 para el grupo control). La prueba de Levene indica que ambas varianzas se pueden considerar iguales (p=0.185), y en base a eso, la prueba t de student nos indica que la diferencia observada entre las medias del grupo de pacientes y controles no es significativa (p=0.061; IC 95 % para la diferencia -0.312-1.329 %).

Figura 90: Distribución normal del porcentaje de citosinas metiladas. Representación gráfica de la distribución normal del porcentaje de citosinas metiladas en el grupo control de individuos sanos y el grupo de pacientes con alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética. Arriba, grafico Q-Q Normal para ambos grupos. Abajo, Diagrama de cajas.

Grupo Control Grupo Paciente Valor observado Valor normal esperado % Metilación Control Paciente

Por otra parte, para visualizar la distribución del porcentaje de citosinas metiladas en cada grupo en función del género, se representó un diagrama de cajas apareadas (figura 91) sin observarse diferencias importantes entre el grupo de controles y pacientes de género femenino, pero con una mayor diferencia entre los grupos de género masculino. Para poder apreciar además el efecto de la edad, se realizó una representación gráfica en función de este parámetro (figura 92), observándose que en las mujeres, tanto del grupo control como del grupo de pacientes, no hay una tendencia a variar el porcentaje de citosinas con la edad, mientras que en los varones parece observase una disminución con los años.

Figura 91:Diagrama de cajas apareadas según el género. Representación gráfica de la distribución del porcentaje de citosinas metiladas en el grupo control y de pacientes subdividido según el género masculino o femenino de los componentes de cada grupo. Teniendo esto en cuenta, se realizó un análisis de regresión lineal multivariante introduciendo un término de interacción género-edad, e incluyendo ambas variables en el modelo (por el principio jerárquico), para poder valorarlas como posibles variables de confusión (tabla 51). El resultado de este análisis indica que hay un efecto significativo en el valor de metilación debida tanto al género (p = 0.020) como a la interacción género-edad (p = 0.037), lo que concuerda con lo observado en la figura 92 donde se muestra un efecto en el grupo de género masculino según su edad. En cualquier caso, no se han encontrado diferencias significativas en el porcentaje de metilación entre el grupo de pacientes con mutaciones en genes de la maquinaria epigenética y el grupo control de individuos sanos (p = 0.106), que era el objetivo de este estudio.

% Metilación

Mujer Varón

Control Paciente

Controles y = 0,0118x + 4,6804 R2 _{= 0,0057} y = -0,0948x + 6,0335 R2 _{= 0,2014} 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 Edad % Metilación Mujeres Hombres Lineal (Mujeres) Lineal (Hombres) Pacientes y = 0,0167x + 4,4334 R2 _{= 0,0202} y = -0,0557x + 4,9911 R2 _{= 0,4227} 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 Edad % Metilación Mujeres Hombres Lineal (Mujeres) Lineal (Hombres)

Figura 92: Representación gráfica de la distribución del porcentaje de citosinas metiladas según el género y la edad en paciente y controles. Arriba grupo control; abajo grupo de pacientes.

Tabla 51: Análisis multivariante del porcentaje de metilación en citosinas. Se incluye, además de las variables grupo (control, 0; o paciente, 1), género (femenino, 0; o masculino, 1) y edad (en años), la variable de interacción entre el género y la edad. C no E C E t p IC B (95 %) B ES Beta constante 4.756 0.356 - 13.378 0.000 4.040 5.472 grupo -0.527 0.319 -0.217 -1.651 0.106 -1.170 0.116 género 1.065 0.443 0.444 2.404 0.020 0.173 1.956 edad 0.016 0.034 0.105 0.474 0.638 -0.052 0.085 género-edad -0.090 0.042 -0.569 -2.146 0.037 -0.175 -0.006 C: Coeficiente; E: estandarizado; ES: Error estándar; IC: Intervalo de confianza.