Hypothesis 1: Predictors of the Adapted Crossover Hop for Distance

A continuación se detalla la metodología aplicada para la obtención de vainillina cruda.

II.3.1. Recuperación de la vainillina cruda

La vainillina (V) cruda fue obtenida a partir de aserrín de cedro siguiendo la

metodología propuesta por Lampman et al.1_{, la cual consiste en una hidrodestilación}

modificada. El aserrín se calienta con una solución de dioxano en un medio básico a reflujo. Bajo las condiciones de reacción, las ligninas presentes en la madera son degradadas de las estructuras poliméricas en las que se encuentran, a compuestos de menor masa molecular por reacciones de condensación aldólica reversa y reacciones de eliminación. Los compuestos de baja masa molecular luego son oxidados a vainillina. Si bien otros aldehídos son producidos durante la recuperación de V, estos son removidos durante la purificación.

La técnica consistió en colocar en un balón 50 g de KOH, 20 g de aserrín y 500 mL de solución HCl-Dioxano:Agua (9:1). La reacción se realizó a reflujo durante 2 h. A la mezcla de reacción obtenida se la diluyó con 450 mL de agua destilada, y se acidificó con HCl diluido hasta alcanzar un pH de 3, a dicha solución se le realizaron extracciones con éter etílico de manera de recuperar la vainillina cruda.

II.3.2. Aislamiento de la vainillina cruda

La vainillina cruda presente en la fase orgánica etérea fue aislada de otros compuestos que se encuentran a nivel de trazas, mediante dos técnicas distintas: a) condensación bisulfítica, y b) cromatografía en columna.

La condensación bisulfítica se basa en la reacción de condensación producida entre un aldehído (vainillina, 1) y el bisulfito de sodio, la cual da como resultado el producto de adición bisulfítica de vainillina (2). A este producto se lo acidifica con ácido sulfúrico concentrado obteniendo así vainillina, según se presenta en la Esquema II.2.

Como en la fase orgánica (FO) está presente la vainillina junto a trazas de otros compuestos, para lograr la separación total de la vainillina, se trató la FO con una solución acuosa de bisulfito de sodio. De esta manera, la vainillina es separada como producto de la condensación. Los extractos bisulfíticos presentes en la fase acuosa (FA), luego de ser separados de la FO, se filtraron para eliminar fase sólida. La FA se acidificó con ácido sulfúrico concentrado, y se le realizaron extracciones con éter etílico. La acidificación se realizó bajo campana, mediante agitación continua y suave. El dióxido de azufre generado se eliminó manteniendo la solución ácida a 60 °C y con agitación durante 1 h. La FO se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se llevó a evaporador rotatorio para eliminar solvente (Esquema II.3).

En el procedimiento de cromatografía en columna se utilizó como fase estacionaria (FE) sílica gel y como fase móvil (FM) hexano:acetato de etilo 1:1.

Esquema II.2. Condensación bisulfítica de la vainillina. Arriba) producto de adición bisulfítico de vainillina, Abajo) vainillina.

II.4. Obtención de eugenol

El eugenol crudo fue obtenido a partir de clavo de olor, pimienta de Jamaica y cáscara de banana. Según la matriz vegetal se evaluaron diferentes metodologías de extracción. Para el clavo de olor fueron evaluados como métodos de extracción: destilación por

arrastre de vapor, hidrodestilación, extracción sólido-líquido y extracción asistida por microondas; mientras que para pimienta de Jamaica y cáscara de banana: extracción sólido-líquido. También se evaluó la presencia del mismo en la canela por extracción sólido-líquido. En todos los casos, se realizaron ensayos previos para determinar las condiciones óptimas de extracción a aplicar. Todos los ensayos se realizaron por

duplicado.

a) Destilación por Arrastre de Vapor (DAV)

Este método se aplicó al clavo de olor, y para lo cual se utilizó 30 g del mismo. Se evaluaron como tiempos de extracción: 2, 4 y 6 h (Ver Anexo A).

b) Hidrodestilación (HD)

La matriz vegetal estudiada por este método fue el clavo de olor (30 g). Las extracciones se realizaron por duplicado a 2, 4 y 6 h (Ver Anexo A).

c) Extracción Sólido-Líquido (ELS)

Las matrices vegetales estudiadas fueron: clavo de olor, pimienta de Jamaica y cáscara de banana. Se utilizaron dos equipos: a) extractor Soxhlet y b) extractor Twisselman. En a) inicialmente las experiencias se realizaron con solventes de distinta polaridad (agua, n- hexano y etanol) durante el mismo tiempo, a los fines de comparar los rendimientos de los compuestos de interés y elegir así el solvente que permitía obtener un mayor rendimiento.

Una vez identificado el solvente óptimo se procedió a analizar los distintos tiempos de extracción (2 h, 4 h, y 6 h). Mientras que en b) se partió de la misma cantidad de materia vegetal que el caso anterior, empleando como solvente etanol (150 ml). El procedimiento se realizó durante 2, 4 y 6 h, y solo se aplicó al clavo de olor.

d) Extracción Asistida por Microondas (EAM)

Los experimentos se realizaron para el clavo de olor de acuerdo con un diseño

experimental de Taguchi, considerando 5 niveles y 5 factores (L25) (Anexo B), el cual

proporciona un conocimiento completo de cada factor y su efecto en los rendimientos. Dicha metodología analiza el resultado utilizando un indicador estadístico denominado relación señal/ruido (S/N) que traduce la información experimental en un solo valor que

muestra la presencia de disparidad2_{. A los resultados obtenidos en cada una de las}

relación señal a ruido (S/N). Luego, se realizó el análisis de la varianza (ANOVA) para encontrar los factores más y menos influyentes en el proceso a fin de poder tomar decisiones según los objetivos planteados. También se calculó el estadístico F; un mayor valor de F indica un mayor efecto en los rendimientos debido a los cambios en los parámetros del proceso.

El microondas de laboratorio que se utilizó fue un Anton Paar Monowave 300. Debido a que el microondas no puede controlar simultáneamente la potencia y temperatura en un experimento, solo fue analizada la temperatura. El rango de variación de la misma fue desde 30 a 70 °C, debido a que temperaturas más altas favorecen la degradación de los compuestos extraídos. Con el fin de evitar el riesgo de degradación térmica y oxidación, el tiempo de extracción EAM generalmente varía desde unos minutos hasta media hora para la extracción de AE. De manera que el mismo fue establecido entre 5 y 25 minutos. Otro de los parámetros estudiados fue la agitación. Los valores establecidos en los niveles corresponden a 20, 40, 60, 80 y 100% del valor máximo que puede alcanzar el equipo que es de 1200 rpm. El solvente usado fue etanol (78°) en relaciones etanol:agua de 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100. La elección del mismo se debió a que es un buen absorbedor de ondas microondas. El volumen de solvente se seleccionó de acuerdo a la capacidad volumétrica de las celdas de reacción, las cuales varían entre 6 y 20 mL. La relación solvente/sólido es importante porque asegura un calentamiento homogéneo y efectivo. Para optimizar los parámetros de éste proceso se evaluaron los resultados obtenidos del diseño experimental de Taguchi.

II.4.1. Aislación de eugenol

El eugenol fue extraído de los aceites esenciales por medio de dos procedimientos: extracción química y por cromatografía en columna.

a) Extracción química (mediante adición de una base)

A la mezcla obtenida en los métodos de extracción (AE + agua) se le realizaron extracciones con diclorometano y luego a la fase orgánica se la trató con hidróxido de sodio al 5 %. De este modo, el eugenol se encontró bajo la forma de su sal fenólica, la cual es soluble en medio acuoso. El posterior lavado de la fase acuosa básica con diclorometano extrajo los posibles componentes orgánicos en dicha fase. Seguidamente, se la trató con HCl diluido para obtener el fenol extrayéndose con un solvente orgánico. Esta fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se llevó a evaporador

rotatorio para eliminar el solvente. La separación y purificación de los productos obtenidos se controlaron por medio de cromatografía de capa fina (Esquema II.4).

b) Aislación de eugenol mediante cromatografía en columna Se realizó el mismo procedimiento utilizado en la vainillina. II.5. Obtención del cinamaldehído

La canela se utilizó como materia vegetal para obtener cinamaldehído debido a su alto contenido de este componente. El método utilizado fue la extracción sólido-líquido por

medio de un equipo Soxhlet, empleándose el mismo procedimiento que se detalló para el eugenol.