La fluorescencia es el proceso de emisión de luz por moléculas que son excitadas con radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su exceso de energía y se relajan a su estado fundamental. Dos de los mecanismos de relajación más importantes son la relajación o desactivación no radiante, que incluye relajación vibracional y conversión interna, y la relajación fluorescente, comúnmente llamada fluorescencia. El diagrama de Perrin-Jablonski (Figura III.3) es conveniente para visualizar de manera sencilla los posibles procesos: absorción de fotones, conversión interna, fluorescencia, cruce entre sistemas, fosforescencia,
fluorescencia retrasada y transiciones triplete-triplete.
Los estados electrónicos singulete se denominan S0 (estado electrónico fundamental),
S1 y S2 corresponden al primero y segundo estado singulete excitado. La línea T1
corresponde al primer estado triplete excitado. De manera que los niveles vibracionales están asociados con cada estado electrónico. Una vez que la especie ha sido excitada por absorción de un fotón, puede volver al estado fundamental con emisión de fluorescencia o
mediante diferentes procesos tal como se muestra en la Figura III.435.
Figura III.3. Diagrama de Perrin–Jablonski.
Tras las interacciones con los iones metálicos, la intensidad de fluorescencia y/o el cambio de la banda de fluorescencia de los quimiosensores cambian y los iones metálicos
se pueden detectar cualitativa y cuantitativamente36.
El éxito de la fluorescencia surge de la alta sensibilidad de las técnicas fluorométricas, la especificidad de las características de fluorescencia debidas al microambiente de la molécula emisora y la capacidad de éste último para proporcionar información espacial y temporal. La Figura III.5 muestra los parámetros físicos y químicos que caracterizan el
microambiente y puede así afectar las características de fluorescencia de una molécula35.
III.4.1. Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de fluorescencia (ϕF) es la relación entre
el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número total de moléculas excitadas, según se expresa en la Ecuación III.2. Para moléculas altamente fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies químicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
Las técnicas para estimar el rendimiento cuántico en estructuras altamente conjugadas pueden agruparse en dos: métodos absolutos y métodos relativos.
Métodos absolutos: carecen de popularidad debido principalmente al uso de metodologías e instrumentos con requerimientos tecnológicos altos lo cual implica una
Figura III.5. Parámetros que influyen en la emisión de fluorescencia.
?? = ?° ??????? ????????
inversión económica considerable. Se aplican a especies en disolución o compuestos en fase sólida.
Métodos relativos: son más accesibles y se basan en el empleo de sustancias patrón
con rendimientos cuánticos ampliamente estudiados y conocidos37. Éstos últimos se
aplican únicamente a especies en disolución y las mediciones se realizan mediante espectrómetros de absorción y emisión. Se calcula mediante la Ecuación III.3:
Donde:
??? = Rendimiento cuántico de fotoluminiscencia de la muestra
??? = Rendimiento cuántico de fotoluminiscencia del patrón
?? = Intensidad integrada (área) del espectro de la muestra (en unidades de fotones)
?? = Intensidad integrada (área) del espectro del patrón (en unidades de fotones)
?? , ?? = Factor de absorción, es decir, la fracción de la luz incidiendo en la muestra
que se absorbe (?? = 1 − 10−?), siendo A la absorbancia
?? = índice de refracción de la muestra
??= índice de refracción del patrón
III.4.2. Mecanismos de actuación
Los fluoronóforos son herramientas poderosas para la medición de la concentración de iones en muestras ambientales o biológicas. Como se dijo anteriormente, una preocupación clave en el diseño de tales sensores es la conexión entre el reconocimiento del sustrato y
los cambios fotofísicos en el fluoróforo informante38.
Los mecanismos de detección convencionales, basados en diferentes procesos fotofísicos se clasifican de manera simple como según se presenta en el Esquema III.1 y se describen a continuación:
i) Transferencia electrónica (TE): incluye la transferencia electrónica fotoinducida (PET, del inglés Photoinduced Electron Transfer).
ii) Transferencia de carga (TC): incluye la transferencia de carga intramolecular (ICT), transferencia de carga fotoinducida (PCT), transferencia de carga metal-ligando (MLCT) y la transferencia de carga intramolecular trenzada (TICT).
iii) Transferencia de energía (TDE): incluye la transferencia de energía electrónica (EET) y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).
??? = ?? ?? ??2
?? ?? ??2 ??
iv) Formación de excímero: un excímero se define como un complejo formado por la interacción de un fluoróforo en el estado excitado con un fluoróforo de la misma estructura en el estado fundamental. Del mismo modo, si el fluoróforo en el estado excitado es diferente del fluoróforo en el estado fundamental, el complejo resultante se denomina exciplex. El espectro de emisión de un excímero/exciplex se desplaza hacia el rojo en comparación con el del monómero, y a menudo se observa simultáneamente una emisión
doble del monómero y del excímero/exciplex39.
En todos estos casos, el primer paso requerido es la absorción de un fotón para alterar la distribución de carga dentro del cromóforo: mantener, amplificar o, en circunstancias menos favorables, destruir el potencial químico resultante depende de la dinámica que
puede ocurrir dentro del cromóforo inmediatamente después del evento de absorción40.
La transferencia electrónica fotoinducida (PET) está implicada en muchas reacciones fotoquímicas orgánicas y suele ser la responsable del amortiguamiento de la fluorescencia en complejos metálicos con ligandos orgánicos. Para que ocurra la transferencia de un electrón de una entidad molecular a otra, o entre dos partes localizadas de una misma molécula, se requiere de la existencia de dos componentes, una entidad molecular o una parte de una misma molécula de la cual procede el electrón, llamada dador (D), y otra entidad molecular o parte de una misma molécula, la cual es receptora del electrón,
llamada aceptor (A). Este método permite el diseño de sensores luminiscentes “off-on”, y
además es lo suficientemente flexible como para permitir la construcción de sensores “on-
off” donde la entrada del invitado desconecta o disminuye la luminiscencia, que es la
intensidad de fluorescencia36,41–43.
Si el amortiguador es una especie rica en electrones (D) presenta entonces una tendencia reductora y transferirá un electrón desde su HOMO a un orbital HOMO semi-
ocupado del fluoróforo excitado (A), formándose la especie A-D+. A continuación tendrá
lugar una retrodonación electrónica del LUMO del fluoróforo hacia el HOMO de la
especie D+, semiocupado ahora, llegando así ambas partes a su estado fundamental, según
se presenta en la Esquema III.2.
También puede ocurrir que el amortiguador presente un comportamiento oxidante siendo así la especie aceptora de electrones. Dispondrá de un orbital vacío o semiocupado de energía adecuada para que se transfiera un electrón del orbital del fluoróforo excitado (D*). El centro amortiguador permite desactivar la energía fotónica a través de una vía no
radiativa, que genera el estado de transición D+A-, según se muestra en el Esquema III.3.
Mediante el proceso de retrodonación el sistema vuelve al estado fundamental amortiguando así la fluorescencia natural.
En los sensores basados en transferencia de carga intramolecular (ICT), la transferencia de carga intramolecular es un proceso de transferencia de electrones que se produce tras la fotoexcitación en moléculas que normalmente son sistemas conjugados π que presentan un donador de electrones y un aceptor de electrones conectados a través de un puente conjugado π. Este mecanismo da como resultado una característica ratiométrica que permiten señales de relación aumentando así el rango dinámico y proporcionando una
corrección incorporada para las interferencias ambientales44,45.
Esquema III.2. Esquema del orbital que ilustra el amortiguamiento de un fluoróforo fotoexcitado (A*) por un amortiguador reductor (D), por un proceso de transferencia electrónica (PET) de D a A*. El par iónico que se forma (A*, D*) se recombina por un proceso de retro-donación electrónica no radiativa. Así la emisión natural de A* queda amortiguada.
En la transferencia de carga fotoinducida (PCT), un fluoróforo que contiene un grupo donador de electrones conjugado con un grupo atractor de electrones se somete a transferencia de carga intramolecular desde el donante al aceptor al ser excitado por la luz. El catión acomplejado afecta así la eficiencia de la transferencia de carga intramolecular, ya que reduce el carácter donador y esto provoca una desestabilización del momento dipolar en el estado excitado (cambio de Stokes que depende del microambiente del fluoróforo). Debido a la reducción resultante de la conjugación, se espera un desplazamiento hacia el azul del espectro de absorción junto con una disminución del coeficiente de absorción molar. Por el contrario, un catión que interactúa con el grupo aceptor aumenta el carácter atractor de electrones de este grupo estabilizando el estado excitado. El espectro de absorción se desplaza al rojo y se aumenta el coeficiente de
absortividad molar46.