4.2 Background
4.3.2 Identification strategy
Este estudio experimental tuvo como objetivo desarrollar y validar un método rápido y confiable por cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC) para la cuantificación de Ácido Acetilsalicílico en tabletas de 100mg.
Diversos métodos analíticos empleando cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) han sido relatados para la determinación de Ácido Acetilsalicílico en el 2014 se desarrolló un método analítico indicador de estabilidad por HPLC fase móvil de Fosfato monobásico de Sodio y Acetonitrilo (85:15) flujo de 2ml/min volumen de inyección 20µL13.
En el 2015 Poma Mamani y colaboradores realizaron un estudio de degradación de la aspirina en tabletas utilizando un método cromatógrafo HPLC fase móvil buffer pH 2,4: acetonitrilo14.
Después de elegir el mejor sistema cromatógrafo empleando Solución A: Metanol HPLC (900: 100). como fase móvil y condiciones cromatografías: 281nm de longitud de onda; 0,45 mL/min de flujo, 1,5 uL de volumen de inyección y 5 minutos de tiempo de corrida siendo este método específico para el analito se evaluaron los parámetros de validación.
Los resultados de los parámetros de desempeño de validación del método analítico por cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC) para la cuantificación de Ácido Acetilsalicílico 100 mg tableta, se presentan en la tabla 1, donde se observa que, al efectuar el análisis del placebo, se observa ausencia de respuesta que interfiera en la determinación. Se determinó además la especificidad del método al hallar el porcentaje de recuperación, con este parámetro se comprueba la ausencia de interferencia del placebo. Se concluye que el placebo no interfirió en el análisis del producto.
Al realizar las diferentes degradaciones al Principio Activo, Placebo y Muestra se observa que no existe ninguna interferencia en el tiempo de retención de Ácido acetilsalicílico con alguno de los potenciales productos de degradación al ser analizados.
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En la evaluación de linealidad del sistema se analizaron las siguientes concentraciones: 50%, 75%, 100%, 125% y 150 % tomando como 100% la concentración de 0,5 mg/mL las cuales al ser evaluadas estadísticamente dieron un coeficiente de correlación (r) de 0,9999 siendo el valor minino permitido de 0,995 lo cual demuestra que existe una correlación positiva entre la variable concentración (x) y la variable respuesta (y), se obtuvieron coeficiente de determinación (𝑟2) de 0,9997 siendo el valor mínimo permitido de 0,9980.
La evaluación de la linealidad no solo implica una representación gráfica, sino que es necesario realizar una comprobación estadística en bases a interferentes (intervalo de confianza) y pruebas de hipótesis que permitan determinar la significancia estadística de los resultados. Dos de las pruebas más usadas son: el test de linealidad y el test de proporcionalidad. La primera permite verificar la linealidad del método estimando la significación estadística de la varianza estándar de la pendiente, en la que se trata de comprobar que existe una pendiente significativamente distinta a cero mediante la prueba de test de student. La segunda prueba, permite evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas determinando si el término independiente es significativamente distinto de cero. 37
Al determinar el límite de confianza de la pendiente se determinó que el valor hallado (b=418701521,0026) se encuentra entre los límites de confianza 414642884 y 422760158 el cual no incluye al cero; en el test de student el valor de 𝑡𝑒𝑥𝑝= 222,87 es mayor a 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎=
2,160 , este valor tan alto indica que la probabilidad de ser 𝑏 ≠ 0 es muy elevada, superior al 99,5% si fuera 𝑏 = 0, significaría que la recta es paralela al eje de las abscisas y no habría regresión. Para el caso del límite de confianza del término independiente se determinó que el valor hallado (a=974489,6769) se encuentra entre límites de confianza -1179121,75 y 3128101,11 el cual incluye al cero, en el test de student el valor de 𝑡𝑒𝑥𝑝0,98 es menor a 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎= 2,160 es menor a la tabla este valor indica que la probabilidad de ser 𝑎 = 0 es muy elevada, superior al 99,5% lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero. Para el factor respuesta se observó un valor de 0,62% (< 2%), dentro de lo permitido, así que la dispersión encontrada en los cocientes concentración/respuesta es aceptable. En la representación de los residuales se observó que la distribución de sus puntos es de forma aleatoria y no refleja ninguna tendencia la cual demuestra la validez del modelo.
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80%, 100%, y 120 % tomando como 100% la concentración de 0,5 mg/mL donde para verificar la relación concentración/respuesta del analito se realizó una regresión lineal por el método de los mínimos cuadrados, en el cual se obtuvo una curva de calibración con una ecuación de la recta y = 419729x + (- 790861,99) que cumple con el modelo y= bx +a , las cuales al ser evaluadas estadísticamente dieron un coeficiente de correlación (r) de 0,9996 siento el valor minino permitido de 0,995 lo cual demuestra que existe una correlación positiva entre la variable concentración (x) y la variable respuesta (y) y se obtuvieron coeficiente de determinación (r2) de 0,9992 siendo el valor mínimo permitido. Al determinar el límite de confianza de la pendiente se determinó que el valor hallado (b=419729) se encuentra entre los límites de confianza 409333 y 430125 el cual no incluye al cero; en el test de student el valor de 𝑡𝑒𝑥𝑝 = 95,47 es mayor a 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎= 2,36 , este valor tan alto indica que la probabilidad de ser
𝑏 ≠ 0 es muy elevada, superior al 99,5% si fuera 𝑏 = 0, significaría que la recta es paralela al eje de las abscisas y no habría regresión. Para el caso del límite de confianza del término independiente se determinó que el valor hallado (a= 790861,99) se encuentra entre límites de confianza -6131778,80 y 4550054,8 el cual incluye al cero, en el test de student el valor de 𝑡𝑒𝑥𝑝 = 0,35 es menor a 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 = 2,36 este valor indica que la probabilidad de ser 𝑎 = 0 es muy elevada, superior al 99,5% lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero. Para el factor respuesta se observó un valor de 0,50% (< 2%), dentro de lo permitido, así que la dispersión encontrada en los cocientes concentración/respuesta es aceptable. En la representación de los residuales se observó que la distribución de sus puntos es de forma aleatoria y no refleja ninguna tendencia la cual demuestra la validez del modelo.
En el estudio de precisión del método mostro una buena repetibilidad de los resultados, obteniéndose un coeficiente de variación (CV) de 0,11% siendo el valor máximo de 2% determinándose los límites de confianza entre resultados individuales y resultado promedios siendo 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 = Test de Student para (n-1), grados de libertad con un grado de confianza del 95% cuando el número de réplicas es inferior a 30. Para el caso de la precisión intermedia, dos analistas analizaron en la concentración al 100% resultando un CV entre ambos de 0,89% siendo el valor máximo 2%. Con esto se comprobó el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medida de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las condiciones establecida del método analítico aplicado. De este modo, podemos constatar que el método fue suficientemente preciso, por lo que no repercutieron
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apreciablemente los errores aleatorios en la determinación, considerando que la variabilidad del método puede deberse a errores aleatorio inherentes a todo método de ensayo.
En el estudio del límite de detección se usó el método basado en la extrapolación de la recta por lo que se analizaron concentraciones: 10%, 20% y 30% las cuales se evaluaron estadísticamente dando un coeficiente de correlación (r) de 0,9990 siendo el valor mínimo permitido de 0,995 la cual demuestra que existe una correlación positiva
A partir del análisis por extrapolación se determinó el límite de detección en la concentración de 0,0199 mg/mL, siendo la cantidad mínima teórica de Ácido salicílico en una muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. El límite de cuantificación se determinó en la concentración de 0,00603 mg/mL siendo la cantidad mínima teórica de Ácido salicílico en una muestra que puede cuantificarse en las condiciones experimentales indicadas. De esta forma se demuestra la factibilidad del método para las condiciones de análisis preestablecidas
En el estudio de exactitud del método se recuperó el 100,06% del principio activo siendo los limites aceptados de 98% a 102% y el valor de coeficiente de variación fue de 0.50% siendo el máximo permitido 2%. Para demostrar que no hay diferencia significativa entre la recuperación media y el 100% se aplicó un test student donde el valor de 𝑡𝑒𝑥𝑝= 2,3 es menor a 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎= 2,306 con 𝑝 = 0,05 y n-1 grados de libertad lo cual indica que no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100% confirmando una buena exactitud del método.
En este estudio de la robustez se evaluó la estabilidad de las muestras en 2 condiciones: en muestras después de 24 horas a temperatura ambiente y en refrigeración, donde se observó que los cambios realizados en las condiciones del método analítico no afectan la reproducibilidad de los resultados ya que cumplieron con el criterio de aceptación de alteración siendo menor a 2% por lo tanto el método cumple con el parámetro de robustez.