Impact of the Programme

3.1. Cultivo de células:

Las células endoteliales humanas procedieron de una línea de endotelio humano, EA.hy926, obtenida en American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Las células crecieron en el medio Dulbeco’s Modified Eagle Media, suplementado con 4.5 g/L de glucosa, 10% de suero de ternera fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina, a 37ºC, en una atmósfera con CO2 al 5%. Los experimentos se realizaron rutinariamente en células confluentes en monocapa.

3.2. Aislamiento de monocitos y cocultivo con células endoteliales:

Los monocitos fueron obtenidos por aislamiento de la sangre total mediante centrifugación diferencial en gradiente utilizando el reactivo Ficoll(Fuss et al. 2009). Para ello, la sangre fue diluida 1:2 con buffer salino fosfato (PBS) (139 mM NaCl, 8.66 mM Na2HPO4, 1.4 mM

49

NaH2PO4, pH 7) y después fue añadida lentamente sobre el reactivo Ficoll en un tubo cónico. Las muestras se centrifugaron primero a 600 g durante 45 minutos, sin freno. La capa blanquecina y algodonosa que contenía los monocitos fue recogida cuidadosamente en otro tubo al que se añadió PBS para lavar del exceso de Ficoll (Figura 12). Las muestras se centrifugaron una segunda vez a 800 g durante 15 minutos, para obtener un precipitado de células, que se recogieron en una cantidad conocida de PBS para ser cuantificadas en una cámara de Neubauer.

Tras cuantificar el número de monocitos de cada muestra se procedió a coincubar un millón de monocitos con células endoteliales confluentes crecidas en pocillos, por duplicado, durante 24h. Al finalizar la incubación, se recogieron los sobrenadantes de las células para ensayar la toxicidad celular. Las células se lavaron 2 veces con PBS para extraer proteínas de un pocillo y ensayar la adhesión de monocitos al endotelio por citometría de flujo del otro pocillo duplicado.

Figura 12. Aislamiento de monocitos de sangre total.

3.3. Adhesión de monocitos a células endoteliales:

Las células endoteliales confluentes fueron incubadas con 1 millón de monocitos de cada paciente. Tras 24 h de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se recogieron para ensayar la adhesión de monocitos al endotelio por citometría de flujo. Estas células se incubaron por duplicado con un anticuerpo específico anti-CD14 conjugado con ficoeritrina (CD14-PE), que reconoce específicamente monocitos, durante 30 minutos, a temperatura ambiente y en oscuridad. El control negativo se hizo con células incubadas en las mismas condiciones con el mismo isotipo de CD14-PE, un anticuerpo IgG2a-PE. Transcurrido este tiempo, las células endoteliales fueron centrifugadas a 1500 rpm para eliminar el exceso de anticuerpo no unido, y se resuspendieron en 500 µl PBS para ser adquiridas en el citómetro de flujo (FC 500, Beckman Coulter, CA, USA). La cantidad de monocitos adheridos a dichas células endoteliales fue determinada como CD14-PE+.

x 600 g 45 min 10 ml sangre Diluir 1:2 con PBS 3 ml Ficoll Ficoll Monocitos Eritrocitos Plasma

50 3.4. Toxicidad celular:

La toxicidad celular fue evaluada en todas las condiciones experimentales mediante el método de exclusión del azul trypan y por la cuantificación de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio de cultivo, tras recoger el sobrenadante procedente del cocultivo de las células endoteliales con el millón de monocitos de cada paciente.

3.5. Expresión de proteínas por Western blot:

Las proteínas totales fueron aisladas o bien de células endoteliales que habían sido incubadas previamente 24 h con 1 millón de monocitos, o bien de una parte de los monocitos que habían sido aislados con el Ficoll. En ambos casos, se utilizó un Buffer de lisis que contenía: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0.1 % deoxicolato sódico, 1 % Triton X-100, 10 mM pirofosfato sódico, conteniendo un cocktail con inhibidores de proteasas. La concentración proteica se determinó con un ensayo de BioRad. Las proteínas (30 µg) fueron separadas en un gel de acrilamida-bisacrilamida al 6% SDS-PAGE en condiciones reductoras, y después transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1h a temperatura ambiente con 5 % de leche en polvo desnatada diluida en Tris buffer con Tween 20 (TBST) (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.9 % NaCl, 0.05 % Tween 20). Tras la incubación las membranas se lavaron 3 veces con TBST durante 5 minutos, después se incubaron con los anticuerpos primarios según la proteína a estudiar: anti- ECE-1 (mAb AEC32-236, 10 µg/mL, 90 min, anticuerpo proporcionado por el Dr. Kohei Shimada, Biological Research Laboratories, Sankyo Co., Ltd. Tokyo, Japan), anti-eNOS (dilución 1:3000, 1h), en el caso de las proteínas extraídas de las células endoteliales; ó anti- Hsp70/90 (dilución 1:750, 5%BSA, toda la noche a 4ºC) para las proteínas que habían sido extraídas de los monocitos directamente. Las membranas volvieron a ser lavadas 3 veces con TBST, y finalmente se incubaron con un anticuerpo secundario anti-mouse IgG (dilución 1:50.000, 1h) para ECE-1 y eNOS (Martinez-Miguel et al. 2013), o anticuerpo anti-rabbit (dilución 1:10000, 1h) para Hsp70/90. Las bandas de proteínas se visualizaron con el sistema de detección SuperSignal tras 30-60 segundos de exposición a una película MXB. Todas las membranas fueron rehibridadas con otro anticuerpo anti-Actina para normalizar la carga de proteína y corregir los niveles de ECE-1, eNOS, Hsp70 y Hsp90.

3.6. Producción de ROS:

Una porción de los monocitos aislados de sangre total se incubó 30 minutos a 37ºC con la sonda dihidro-dicloro-fluoresceína en su forma reducida. Durante este tiempo de incubación, los radicales libres oxidaron la sonda, dando otro producto fluoresceína oxidado que emite una fluorescencia detectable por citometría de flujo, siendo su cantidad directamente proporcional a la cantidad de ROS presentes en los monocitos.

51

Figura 13. Oxidación de la sonda dihidro-dicloro-fluoresceína por las ROS.

3.7. Cuantificación del porcentaje de monocitos activados CD14+CD16+:

Para evaluar la expresión de CD14 y CD16 en monocitos, se marcaron 100 µl de sangre total con 4 µl del anticuerpo CD14 marcado en rojo con ficoeritrina (PE), y con 4 µl de CD16 marcado en verde con fluoresceína isocianato (FITC). La reacción fue incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente, en oscuridad y en agitación. Cada muestra fue procesada por triplicado, añadiendo además, un control negativo que se realizó con sangre y los isotipos del CD14-PE y CD16-FITC, que eran IgG2a-PE y IgM-FITC. Tras la incubación, se procedió a romper los glóbulos rojos añadiendo un buffer de lisis (1x BD FACS Lysing solution de Becton Dickinson, CA, USA) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células marcadas se lavaron 3 veces con PBS, centrifugando 5 minutos a 1500 rpm cada vez, para eliminar restos de anticuerpos no unidos a las células. Por último, las células se recogieron en 500 µl de PBS conteniendo un 3% de formaldehído. De este modo, se fijaron para poder ser adquiridas en el citómetro FACScan (FC 500, Beckman Coulter, CA, USA). La cantidad de monocitos activados en sangre total de cada paciente fue determinada como CD14+CD16+, después de restarle el fondo de fluorescencia de sus negativos.