Operation of the Programme

2.1. Criterios de inclusión:

Todos los pacientes incluidos en los estudios debían cumplir las siguientes condiciones: - Padecer ERC con necesidad de tratamiento con hemodiálisis.

- Recibir tratamiento con hemodiálisis durante al menos 4 meses, con una duración de la sesión de hemodiálisis de 240±20 minutos.

- Ser mayor de edad.

- Ausencia de enfermedad grave intercurrente con esperanza de vida menor de un año. - En las mujeres, ausencia de embarazo.

45 2.2. Diseño por estudios:

•Comparación del efecto de dos membranas sintéticas de alta permeabilidad, polietersulfona y polisulfona sobre la funcionalidad endotelial.

Para comparar el efecto de polietersulfona (PES) con polisulfona (PS), (ver Tabla 6), se realizó un estudio piloto de intervención con diseño antes-después en el que se incluyeron 10 pacientes. Cada paciente fue control de sí mismo y fue dializado durante 2 semanas con cada una las dos membranas en estudio, realizándose un periodo de lavado de otras 2 semanas con una membrana de polisulfona de bajo flujo (PS bajo flujo), según la descripción del esquema inferior (Figura 8). Para evaluar el efecto agudo de una única sesión de hemodiálisis con las membranas en estudio se realizó extracción de analítica en sangre al inicio (pre-HD) y al final (post-HD) de la sesión de hemodiálisis con cada membrana en estudio. Para evaluar el efecto de 15 días de tratamiento se realizó extracción de sangre pre-HD el primer día en que se utilizó el dializador en estudio y tras 15 días de tratamiento.

Figura 8. Estudio piloto con diseño antes-después (n=10), (Objetivo 1.1).

Para comparar el efecto de polietersulfona con polisulfona, (ver Tabla 6), sobre la funcionalidad endotelial, se realizó posteriormente un estudio prospectivo multicéntrico cuasi- experimental en el que fueron incluidos 30 pacientes. Se trata de un estudio de intervención cuasi-experimental, porque se formaron dos grupos de tratamiento, en cada uno de los cuales se estudió el efecto de una de las dos membranas en estudio, pero no fue posible realizar un proceso de randomización. Los dializadores fueron asignados a los pacientes según la disponibilidad del centro de tratamiento. De este modo, se constituyeron dos grupos, el grupo en el que se evaluó el efecto de polietersulfona, con 19 pacientes, y el grupo en el que se evaluó el efecto de polisulfona, con 11 pacientes. Para evaluar el efecto agudo de una única sesión de hemodiálisis con las membranas en estudio, se realizó una extracción de sangre al inicio (pre-

---15 días--- ---15 días--- ---15 días--- ---15 días---

Recogida de muestras Pre-HD

(Efecto15 días)

Pre-HD (Basal2)

Post-HD (Efecto agudo)

Pre-HD (Basal1)

Post-HD (Efecto agudo)

PES/PS

PS

Bajo flujo _PES/PS

Basal

PS Bajo flujo

Pre-HD

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HD) y al final (post-HD) de la sesión de hemodiálisis el primer día en que se utilizó cada membrana en estudio. Para evaluar el efecto crónico de 3 meses, se realizó extracción de sangre pre-HD el primer día de utilización de la membrana en estudio, y tras 3 meses de tratamiento, según el esquema de la Figura 9.

Figura 9. Estudio prospectivo multicéntrico (n=30), (Objetivo 1.2).

•Comparación del efecto de la polinefrona con respecto a otros dializadores sobre la activación monocitaria.

Se realizó un estudio piloto con 9 pacientes para comparar el efecto de la polinefrona (PN) respecto al triacetato de celulosa (TC), (ver Tabla 7). El diseño del estudio fue de intervención antes-después, siendo cada paciente control de sí mismo. Los pacientes incluidos en el estudio recibían tratamiento con TC desde hacía al menos 4 meses. Este dializador fue sustituido por PN durante otros 4 meses. Para evaluar el efecto agudo de una sesión de hemodiálisis con cada uno de los dos dializadores sobre la activación monocitaria se realizó una extracción sanguínea pre y post-HD. Para evaluar el efecto crónico de 4 meses de tratamiento con cada dializador en estudio se realizaron dos analíticas pre-HD con una diferencia de una semana tras 4 meses de tratamiento con cada dializador. Se hizo una media de los dos resultados obtenidos pre-HD sobre los parámetros de activación monocitaria para asegurar la reproducibilidad de los resultados. El diseño del estudio se detalla en el esquema de la Figura 10.

Figura 10. Estudio piloto con diseño antes-después (n=9), (Objetivo 2.1). ---4 meses--- PN ---1 semana--- ---1 semana--- - Pre-HD Post-HD Pre-HD TC Pre-HD Post-HD Pre-HD Recogida de muestras PES Basal Dializador habitual 3 meses Pre-HD (Basal)

Post-HD (Efecto agudo)

Recogida de muestras

PS

Pre-HD

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Para comparar el efecto de polinefrona (PN) respecto a dos membranas de referencia en la actualidad: helixona (HL) y poliamida (PL) (Tabla 8), se realizó un estudio experimental tipo ensayo clínico con grupo control. En el estudio se incluyeron 47 pacientes, 9 de los cuales formaron el grupo control con un ratio para la aleatorización control-intervención de 1:4. Todos los pacientes recibían al menos desde hacía 4 meses tratamiento con helixona ó poliamida. Nueve pacientes (grupo control), mantuvieron el tratamiento con el mismo dializador. En los restantes 38 pacientes se sustituyó el dializador por polinefrona durante otros 4 meses.

Para evaluar el efecto agudo de una sesión de hemodiálisis con los distintos dializadores sobre la activación monocitaria se realizó una extracción sanguínea pre-HD y post-HD. Para evaluar el efecto crónico de 4 meses de tratamiento se realizaron dos analíticas pre-HD con una diferencia de una semana tras 4 meses de tratamiento con cada dializador. Se hizo una media de los dos resultados obtenidos pre-HD sobre los parámetros de activación monocitaria para asegurar la reproducibilidad de los resultados. El diseño de este último estudio se detalla en el esquema de la Figura 11.

Figura 11. Estudio multicéntrico controlado y aleatorizado (n=47), (Objetivo 2.2). ---4 meses--- PN (38) n= 38 pacientes en HD ---1 semana--- ---1 semana--- Pre-HD Post-HD Pre-HD Pre-HD Post-HD HL (19) PL (19) Grupo PN(n=38) Pre-HD Grupo Control (n=9) HL (7) PL (2) Recogida de muestras ---4 meses--- ---1 semana--- ---1 semana--- Pre-HD Post-HD Pre-HD Pre-HD Post-HD Pre-HD

48 2.3. Recogida de muestras:

Las muestras de sangre extraídas antes y después de hemodiálisis se utilizaron para determinar diferentes parámetros bioquímicos y hematológicos, y para aislar los monocitos. El análisis bioquímico fue necesario para poder calcular la tasa de reducción de pequeñas y medianas moléculas (urea, creatinina y β2-microglobulina), con cada uno de los dializadores en estudio.

En los estudios correspondientes al Objetivo 1, los monocitos se extrajeron de la sangre total por separación en gradiente utilizando Ficoll y se realizó un cocultivo de 1 millón de monocitos con las células endoteliales en cultivo durante 24h. Transcurrido ese tiempo, se recogió el sobrenadante celular para cuantificar la toxicidad celular, y las células para evaluar: por un lado, la adhesión de monocitos al endotelio por citometría de flujo, y por otro, la expresión de proteínas (ECE-1 y eNOS) en dichas células endoteliales, por técnicas de Western blot.

En los estudios correspondientes al Objetivo 2, una porción de sangre se utilizó directamente para cuantificar monocitos activados (subpoblación CD14+CD16+) por citometría de flujo, y el resto de la sangre total se utilizó para extraer lo monocitos por separación en gradiente utilizando Ficoll. En estos monocitos se cuantificó la producción de radicales mediante una sonda dihidro-dicloro-fluoresceína por citometría de flujo, y la expresión de las proteínas Hsp70 y Hsp90 mediante la técnica de Western blot.

Durante todo el seguimiento también se extrajeron muestras para analizar el líquido de diálisis, confirmándose los niveles de endotoxinas (<0,025 unidades), aconsejados por las guías para la realización de diálisis de alto flujo.