2.4 Turbulence and Combustion
2.4.2 Interaction Between Combustion and Turbulence
Los índices de calidad del aceite fueron seleccionados teniendo en cuenta los parámetros incluidos en las monografías de control de la calidad de aceites vegetales reportados en las farmacopeas relativamente recientes, tales como: espectro UV, índice de refracción, densidad relativa, índice de saponificación, índice de acidez, índice de peróxidos, índice de yodo y como ensayo cuantitativo la determinación de ácidos grasos presentes en el aceite. A continuación se exponen los procedimientos de trabajo para cada ensayo[9, 22].
2.2.1. Espectro UV:A 0,05 g de la sustancia a examinar, se le añadió ciclohexanoy se diluyó hasta 50,0 mL con el mismo disolvente. Se desarrolló el espectro de absorción en el intervalo de longitud de onda comprendido entre 200 y 300nm.
2.2.2. Índice de refracción:Se realizó la determinación, utilizando un refractómetro digital de Abbe, teniendo como condiciones 20 ± 0,5°C, en relación a la longitud de onda de la línea D del sodio (λ = 589,3 nm). Se determinó el ángulo límite.
2.2.3. Densidad relativa: Se determinó por la relación entre la masa de 2 mL del aceite a 20 °C y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura en un matraz aforado.
2.2.4. Índice de saponificación:Se introdujo 2 g del aceite en un matraz de vidrio borosilicatado de 250 mL y acoplado a un condensador a reflujo. Se añadió 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 mol/L. Se acopló un condensador y se calentó a reflujo durante 1 hora. Luego se añadió 1 mL de disolución defenolftaleína y se valoró
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inmediatamente (mientras esté caliente) con HCl 0,5 mol/L (n1 mL de HCl 0,5 mol/L). Se realizó un ensayo en blanco en las mismas condiciones (n2 mL de HCl 0,5 mol/L), siendo M la masa de la sustancia a examinar en gramos, se calculó el índice de saponificación por la siguiente expresión:
2.2.5. Índice de acidez:Se disolvió 2 g del aceite en 10 mL de una mezcla formada por volúmenes iguales de alcohol y éter (el disolvente debe ser neutralizado previamente con hidróxido de potasio 0,1M en presencia de 0,5 mL de disolución de fenolftaleína). Una vez disuelto, se valoró con hidróxido de potasio 0,1mol/L. La valoración se da por terminada cuando el color rosa persiste durante 15 segundos por lo menos (n mL de hidróxido de potasio 0,1 mol/L). La masa de la muestra (M) se expresó en g. Se calculó elíndice de acidez empleando la siguiente expresión:
2.2.6. Índice de peróxidos:En un matraz cónico de 250 mL con tapón esmerilado se introdujo 5 g del aceite. Se añadió 30 mL de una mezcla de 3 volúmenes de ácido acético glacial y 2 volúmenes de cloroformo. Se agitó hasta disolver la sustancia y se añadió 0,5 mL de disolución saturada de ioduro de potasio. Se continuó la agitación durante un minuto exactamente, a continuación, se añadió 30 mL de agua. Se valoró con tiosulfato de sodio 0,01 mol/L, añadido lentamente sin dejar de agitar hasta que la coloración amarilla hubiera prácticamente desaparecido. A continuación se añadió 5 mL de disolución de almidón y se prosiguió la valoración agitando enérgicamente hasta la desaparición de la coloración (n1 mL de tiosulfato de sodio 0,01 mol/L). Se realizó una valoración en blanco en las mismas condiciones (n2 mL de tiosulfato de sodio 0,01 M). La valoración en blanco no debe requerir más de 0,1 mL de tiosulfato de sodio 0,01
M
n
28,05
I
1 2 Sn
M
5,61
I
A
n
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mol/L, siendo M la masa de la sustancia en gramos. Se calculó el índice de peróxido por la siguiente expresión:
2.2.7. Índice de yodo: En un matraz aforado de 250 mL, previamente endulzado con ácido acético glacial se añadió 0,15 g de aceite, el cual se disolvió con 15 mL de cloroformo .Se adicionó 25 mL de una solución de bromuro de yodo, posteriormente se dejó tapado durante 30 minutos en un frasco de vidrio ámbar. Transcurrido este tiempo se le incorporó 10 mL de yoduro de potasio y 100mL de agua destilada. Se valoró con tiosulfato de sodio 0,1mol/L; cuando el color amarillo desapareciό se adicionó 5 mL de almidón y se continuó la valoración hasta que el azul intenso desapareció completamente (n1 mL de tiosulfato de sodio 0,1mol/L). Se desarrolló un ensayo en blanco con las mismas condiciones (n2 mL de tiosulfato de sodio 0,1mol/L), siendo M peso del aceite en gramos. Se calculó elíndice de Yodo por la siguiente expresión:
M
n
n
I
I1,269(
2
1)
2.2.8. Determinación cuantitativa de los ácidos grasos presentes en el aceite.
La determinación cuantitativa de los ácidos grasos presentes en el aceite de semilla de
Attalea maripa se realizó por la técnica de cromatografía de gases (CG). El procedimiento de trabajo con esta técnica se subdivide en dos partes, primeramente se identificaron los ácidos grasos en el aceite y posteriormente se validó la técnica para cuantificar los ácidos grasos identificados.
La cromatografía de gases se realizó bajo las condiciones cromatográficas optimizadas por Herrera, 2011, en cuyo trabajo, especialmente la temperatura y la detección, fueron seleccionadas teniendo en cuenta la coincidencia de estas en trabajos reportados que aplicaron esta técnica analítica para el objetivo propuesto en el presente trabajo [53].. En el desarrollo cromatográfico realizado en el presente trabajo se varió la temperatura como parámetro de interés, con vistas a lograr la adecuada resolución cromatográfica
M
n
10
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de los picos correspondientes a los AG. Se trabajó en un intervalo de temperaturas desde 160 a 200 °C hasta lograr la óptima separación cromatográfica de los picos. Los restantes parámetros cromatograficos fueron establecidos en la investigación desarrollada por Herrera, 2011.
2.2.8.1. Derivatización de la muestra y condiciones cromatográficas.
Se pesó 50 mg del aceite de semilla de Attalea maripa, se transfirió a un balón aforado, disolviéndolo con 1 mL de tolueno y 2 mL del ácido sulfúrico al 1% en metanol. Se acopló a un condensador de reflujo y se hizo reflejar durante 2 horas; seguidamente se les incorporó 5 mL de cloruro de sodio al 5%, se trasfirió a un embudo separador, y serealizaron dos lavados sucesivos con 5 mL de heptano y se dejó en reposo hasta lograr una buena separación entre la dos fases (la acuosa y la orgánica). Se desechó la fase acuosa y a la fase orgánica se le adicionó 4 mL de bicarbonato de potasio al 2 %,se recuperó y trasfirió a un tubo de ensayo con sulfato de sodio anhidro, luego de dejarla en reposo se filtró y se rotoevaporó a 40 °C hasta llegar a sequedad .Se disolvió con heptano hasta a un volumen final de 2 mL en un matraz aforado y se guardó en refrigeración hasta su uso.
Las condiciones cromatográficas de la técnica analítica de Cromatografía gaseosa dsarrollada fueron las siguientes:
——Columna capilar de Silice fundida de 30 m de longitud y 0,53 mm de diámetro interno.
— Fase Móvil: Nitrógeno e hidrógeno para cromatografía R, como gas portador y auxiliar, respectivamente, a un caudal de 1,3 mL/min,
— Detector de ionización por llama (T=280 °C.) — Inyector de división (1:100) (T=250 °C).
-- Programa de temperatura: Se inició con una temperatura de 120°C, subiendo a razón de 10°C/min hasta 200°C y finalmente se subió a razón de 20°C/min hasta 220°C. (Tabla 2.1)
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28 Tabla 2.1: Programa de temperatura de la GC-FID aplicada en la determinación de los AG.
Rampa horno °C/min Temp. (°C.) tiempo
Inicial - 120 1 min
Rampa 1 10 200 25
Rampa 2 20 220 -
Se calculó la fracción (%) de cada ácido graso utilizando la ecuación de la recta de la curva de calibración obtenida para cada patrón, teniendo en cuenta las diluciones realizadas en cada caso.
2.2.8.2 Identificación de los ácidos grasos presentes en el aceite.
Para la identificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semilla de Attalea maripa se utilizaron ocho patrones de ácidos grasos metilados disponibles en el laboratorio: Metil Decanoato (caprato), Metil Hendecanoato (undecanoato), Metil Dodecanoato (laureato), Metil Tetradecanoato (miristato), Metil Hexadecanoato (palmitato), Metil Linoleato, Metil Oleato y Metil Octadecanoato (estearato).
Preparación de los patrones: Los patrones fueron disueltos en n-heptano y se prepararon a una concentración de 10 mg/mL (solución madre).A partir de la solución anterior se pipetearon10 µL y se diluyeronen 1 mL de n-heptano. Se inyectό 1 uL de cada patrόn en el cromatόgrafo de gases.
Preparación de la muestra: La muestra fue sometida al procedimiento de derivatización descrito en el acápite 2.2.8.1. A continuación se pipeteó 200 µL en 1 mL de n-heptano y se inyectό 1 uL en el equipo.
2.2.8.3.Validación del método de cromatografía gaseosa para la determinación de tres AG presentes en el aceite (Cáprico, Láurico, Mirístico).
La técnica fue validada para la determinación de los AG cáprico, láurico ymirístico. Se evaluaron los parámetros de desempeño descritos en las normas ICH y CECMED para este método analítico[51-52].El procesamiento de los resultados se realizó utilizando las posibilidades de cálculo estadístico del Microsoft Office Excel, 2010.
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Linealidad
Procedimiento: Se construyeron dos curvas de calibración de cada uno de los patrones.
Preparación de los patrones
Metil Undecanoato (Estándar interno)
Se preparó una solución A (10 mg Metil Undecanoato disuelto en 1 mL de heptano, constituyendo la solución madre).A partir de la solución anterior se preparó una solución B tomando 10 µL y se disolvió en 1 mL de heptano. Se procedió a inyectar en el cromatógrafo de gases.
Metil Caprato
Se pesó 10 mg del metil caprato, se enrasó a 1 mL de heptano constituyendo la solución madre.A partir de la disolución anterior se pipeteό 10 µL y se disolvió en 1 mL de heptano. Las concentraciones del patrón fueron las siguientes: 10 ug/mL, 20 ug/mL, 30 ug/mL, 40 ug/mL. Se procedió a inyectar en el cromatógrafo de gases.
Metil Laureato
Se pesó 10 mg del metil laureato, se enrasó a 1 mL de heptano constituyendo la solución madre, a partir de la cual prepararon las siguientes concentraciones: 100 ug/mL, 150ug/mL, 200 ug/mL, 250 ug/mL. Se procedió a inyectar en el cromatógrafo de gases.
Metil Miristato
Se pesó 10 mg del metil miristato, se enrasó a 1 mL de heptano constituyendo la solución madre,a partir de la cual se preparό una solución B.Para ello se pipeteό 10 µL y se enrasό a 1 mL de heptano. De la anterior solución se prepararon las siguientes concentraciones: 100 ug/mL, 150 ug/mL, 200 ug/mL, 250 ug/mL. Se procedió a inyectar en el cromatógrafo de gases.
Criterios adoptados: r: Coeficiente de correlación múltiple (Criterio ≥ 0,9900); C.V.F:
Coeficiente de variación de los factores de respuestas (Criterio < 5%); Sbrel %: Desviación estándar relativa de la pendiente (Criterio < 2%); Error típico (Et), Desviación estándar de Y (Sy) Criterio Et < Sy; a tSa y Límites de confianza del intercepto (Criterio: Para a Contener el cero). También se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y se determinó el coeficiente de calidad (CC) (Criterio CC < 2,5%)
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Precisión
Procedimiento: Este parámetro incluyó la repetibilidad y la precisión intermedia para cada uno de los tres patrones (metil caprato, metillaureato y metilmiristato). Para la repetibilidad se procesaron seis muestras (concentración 100%) a las cuales se les aplicó la técnica a validar en condiciones homogéneas, un mismo analista y en un mismo día; mientras que la precisión intermedia consistió en un procedimiento similar, con la misma concentración, realizado por diferentes días. En ambos casos se determinó el coeficiente de variación de los resultados.
Criterios adoptados: El coeficiente de variación (CV) para la repetibilidad CV ≤ 2% y para la precisión intermedia CV ≤ 5%. Para evaluar la precisión intermedia se usó, además, el Test de Cochran, el Coeficiente de Variación de Horwitz y un análisis de varianza.
Exactitud
Procedimiento: Se utilizó el método de adición del patrón. Las muestras (concentración 10%)se analizaron por triplicado, aplicándoles el procedimiento de muestra. Para ello se adicionaron a una cantidad conocida de la muestra (50 µL) cantidades crecientes de ambos patrones (Metil Caprato: 10 ppm; 20 ppm; 30 ppm, Metil Laureato: 20 ppm; 30 ppm; 40 ppm y para el Metil Miristato: 20 ppm; 30 ppm; 40 ppm. En cada caso se completo a un volumen de 1 mL de heptano. Se realizaron dos réplicas de cada una de las concentraciones añadidas. Las concentraciones añadidas y recuperadas se representaron en un gráfico y se evaluó el recobrado como el valor obtenido para la pendiente del mismo[50]. Además, se calcularon los porcentajes de recuperación para cada una de las muestras analizadas. Este parámetro se desarrolló en la técnica de cromatografía gaseosa para los tres patrones analizados en este trabajo (ácido cáprico, ácido láurico y el ácido mirístico).
Criterio adoptado:Recobrado en el intervalo 97–103%[50].
Especificidad
Procedimiento: Se compararon los tiempos de retención de las sustancias presentes en la muestra y en el patrón. Se midió, el ancho de la semialtura y se calcularon los
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factores de simetría de los picos en los cromatogramas correspondientes a diez inyecciones de patrón y diez de muestras; se determinó la media y la varianza del patrón y de la muestra, se halló la T de Student y se calculó la F de Fisher, se compararon los valores de T y de F con los tabulados, con el objetivo de descartar posibles solapamientos de picos. Para ello se calcularon los límites de confianza para los factores de simetría por la siguiente ecuación.
Cálculo de los Límites de Confianza para los factores de simetría:
n
S
t
x
Para comparar los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se calcularon los intervalos de confianza de dichos factores, de forma tal que unos intervalos incluyan a los otros.
Límite de detección y Límite de cuantificación
Procedimiento: El límite de detección (LD) se calculó como la concentración de analito que produce una señal igual a tres veces la desviación estándar del blanco (criterio 3σ de la IUPAC)bajo las condiciones experimentales óptimas. El límite de cuantificación (LC) se determinó como la concentración de analito que produce una señal igual a diez veces la desviación estándar del blanco bajo las condiciones experimentales óptimas. Una vez calculados los LD y LC se comprobaron los mismos, aplicando las dos técnicas evaluadas[50, 52, 54].
2.2.8.4. Determinación del contenido de cada ácido graso presente en el aceite estudiado
Se aplicó la técnica validada por Herrera, (2011) para los ácidos grasos Palmítico, Linoléico, Oleico y Esteárico y se procedió a cuantificar los mismos en el aceite evaluado en el presente trabajo. Para ello se diluyó 200 µL de la muestra derivatizada en 1 mL de heptano y se inyectó en el cromatógrafo[53]. Para lacuantificación de los ácidos grasos Cáprico, Láurico y Mirísticose aplicó la técnica validada en el desarrollo del presente trabajo, descrita en el epígrafe 2.2.8.3, para lo cual se diluyó 200 µL de la muestra derivatizada en 1 mL de heptano, se inyectó en el cromatógrafo.