2.3.1 Aislamiento de cloroplastos, tilacoides y estroma a partir de suspensiones celulares y plantas de soja
Los cultivos de suspensiones celulares de soja presentan una tendencia natural a agregarse lo que dificulta su manipulación, a lo que hay que añadir los problemas que presenta la ruptura de la pared celular de estas células. Las distintas fracciones celulares se obtuvieron a partir de 50 ml de cultivo después de tres semanas de crecimiento, tiempo éste en el que los cultivos presentan un color verde intenso.
Las células se filtraron a través de papel Miracloth (Hoechst, Calbiochem) para eliminar el medio de cultivo y se resuspendieron en tampón B1. Este tampón se añade a razón de 1´5 ml/g de células filtradas. La rotura de las células se llevó a cabo con un homogeneizador manual de teflón durante 10 min. Para evitar el calentamiento de la preparación, se interrumpió 1 min el proceso de rotura cada 2 min, manteniendo la muestra constantemente en hielo. El extracto celular se agitó durante 10 min a 4 ºC para favorecer la liberación de los cloroplastos retenidos entre los restos celulares. Posteriormente, el extracto se centrifugó a 300 x g durante 2 min, reservando el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en tampón B1 y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. Los dos sobrenadantes obtenidos anteriormente se mezclaron y se centrifugaron a 13000 x g durante 10 min. El sedimento obtenido contiene fundamentalmente cloroplastos. Este sedimento se resuspendió en tampón B2 con ayuda
de un pincel, provocando la ruptura del cloroplasto por choque osmótico. Los cloroplastos rotos fueron centrifugados a 13000 x g durante 10 min obteniendo como sedimento las membranas tilacoidales y como sobrenadante el estroma. Las membranas fueron resuspendidas en tampón B3 sacarosa y las fracciones del estroma se concentraron en tubos Centripep-10 y Centricon-10 (Amicon).
Se recogieron las hojas de las plantas de soja (60 g) después de 28 días de crecimiento, se lavaron con agua desionizada y se cortaron en trozos pequeños. A continuación, los trozos se homogeneizaron con ayuda de una licuadora en tampón B1 con un volumen de tampón en relación 1:2 (p/v). La mezcla se filtró a través de una capa de papel Miracloth (Calbiochem) y se centrifugó a 300 x g durante 2 min. Los pasos siguientes fueron los mismos que se han descrito para las suspensiones celulares.
Todos los pasos fueron realizados en cámara fría y bajo luz tenue. Tras su aislamiento, los cloroplastos, los tilacoides y el estroma se congelaron en N2 líquido y
almacenaron a -80 ºC. Una vez descongelados deben ser mantenidos a 4 ºC durante su utilización.
Tampón B1 células: 400 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 mM Tricina (pH=8), 0´2% (p/v)
Sacarosa.
Tampón B1 plantas: 400 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 40 mM Ascorbato, 20 mM Tricina
(pH=8), 0´2% (p/v) BSA.
Tampón B2: 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM Tricina (pH=8).
Tampón B3 sacarosa: 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM MES (pH=6), 400 mM
Sacarosa.
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
2.3.2 Aislamiento de cloroplastos intactos a partir de suspensiones celulares y plantas de soja
La obtención de cloroplastos intactos se realizó según el método descrito por van Wijk y col. (1995) modificado según Andreasson y col. (1988), adaptado tanto a suspensiones celulares como a plantas de soja.
Las hojas de soja (60 g), troceadas y lavadas con agua desionizada, se homogenizaron en un homogenizador tipo politrón en presencia de tampón A y, tras
filtrar el homogenizado por dos capas de papel Miracloth (Hoechst, Calbiochem), se agitó suavemente durante 10 min a 4 ºC para favorecer la liberación de los cloroplastos retenidos entre los restos celulares. Posteriormente, el extracto se centrifugó a 300 x g durante 2 min, reservando el sobrenadante. En el caso de las suspensiones celulares (6 g), la homogenización se realizó con un homogenizador de teflón en presencia de tampón A, tal y como se ha descrito anteriormente (apartado 2.3.1). Posteriormente, el lisado se centrifugó a 300 x g durante 1 min.
El sobrenadante obtenido en ambas muestras (plantas y suspensiones celulares) se centrifugó a 1000 x g durante 2 min. Se reservó el sedimento y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 2000 x g durante 5 min. De esta forma, se obtienen en el sedimento fundamentalmente los cloroplastos. Este sedimento se resuspendió en el menor volumen posible (100 μl) de tampón B con ayuda de un pincel y se cargó cuidadosamente sobre un colchón de percoll al 35% (p/v) preparado en tampón B. La muestra se centrifugó a 5000 x g durante 10 min en un rotor basculante. Tras la centrifugación se observó una banda verde intensa de cloroplastos intactos, situada aproximadamente a 1 cm de la superficie del líquido (Fig. 2-5), que recogimos cuidadosamente con una pipeta de boca ancha. Finalmente, los cloroplastos intactos se lavaron con tampón B centrifugando a 1300 x g durante 5 min para eliminar posibles restos de percoll, y se resuspendieron suavemente con ayuda de un pincel en tampón C. Los cloroplastos se conservaron en presencia de los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
Tampón A: 330 mM Sorbitol, 5 mM Ascorbato, 2 mM EDTA, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 0´5 mM KH2PO4, 5 mM MES-KOH (pH=6´1).
Tampón B: 330 mM Sorbitol, 5 mM Ascorbato, 2 mM EDTA, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Tampón C: 330 mM Sorbitol, 5 mM MgCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
Figura 2-5: Aislamiento de cloroplastos intactos mediante centrifugación en percoll. La flecha indica la banda que forman los cloroplastos intactos.
2.3.3 Aislamiento de estroma y tilacoides a partir de cloroplastos intactos de suspensiones celulares y plantas de soja
Los cloroplastos intactos aislados a partir de suspensiones celulares y hojas de soja, tal y como se ha descrito en el apartado 2.3.2, fueron utilizados para aislar tilacoides y estroma. Los cloroplastos intactos fueron recogidos mediante centrifugación y resuspendidos en 5 ml de tampón D con ayuda de un pincel, provocando la ruptura del cloroplasto por choque osmótico. Los cloroplastos rotos fueron centrifugados a 13000 x g durante 10 min, obteniendo como sedimento las membranas tilacoidales y como sobrenadante el estroma. Las membranas fueron resuspendidas en medio B3 sacarosa (300 μl) y las fracciones del estroma se concentraron hasta 100 μl en tubos Centripep-10 y Centricon-10 (Amicon), como se describe en el apartado 2.3.1. Tanto los tilacoides como el estroma aislados se conservaron en presencia de los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
Tampón D: 5 mM MgCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Tampón B3 sacarosa: 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM MES pH=6´0, 400 mM
Sacarosa.
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
2.4 TÉCNICAS BIOQUÍMICAS