Los productos de amplificación obtenidos en la RT-PCR semicuantitativa fueron clonados y secuenciados para identificarlos con total seguridad. Para realizar esta clonación, se siguieron los procedimientos que se describen en los siguientes apartados.
2.2.5.1 Extracción de los productos de PCR de geles de agarosa mediante lana de vidrio
Una vez separados los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, éstos se visualizaron bajo luz ultravioleta y la zona del gel donde se localizó la banda se recortó con un bisturí estéril. El fragmento de agarosa que contiene el DNA se troceó y se colocó junto con 20 μl de H2O miliQ estéril en un eppendorf de 0´5 ml al
que se le había practicado un orificio en el fondo y en el que se había dispuesto lana de vidrio hasta aproximadamente la mitad de su volumen. El tubo con la lana de vidrio y la agarosa se acopló a un tubo eppendorf de 1´5 ml y se centrifugó a 9170 x g durante 10 min. El eluyente obtenido tras la centrifugación contiene el DNA. El tubo con la lana de vidrio se acopló a un nuevo eppendorf de 1´5 ml, se añadieron otros 20 μl de H2O
milliQ estéril y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones anteriores. A los dos eluyentes resultantes se añadió H2O miliQ hasta llegar a los 300 μl de volumen total y
se eliminaron posibles contaminaciones de proteínas extrayendo la fase acuosa superior con un volumen de fenol:cloroformo-isoamilalcohol (1:1, v/v) mediante centrifugación a 5870 x g durante 10 min. Posteriormente se extrajo de nuevo la fase acuosa superior con un volumen de cloroformo:isoamilalcohol (24:1, v/v) mediante centrifugación a 5870 x g durante 10 min. Finalmente, el DNA se precipitó con dos volúmenes de etanol al 96% y 1/5 del volumen de 3 M acetato de sodio a -20 ºC durante como mínimo 1 h. A continuación, se centrifugó a 13200 x g durante 30 min, se decantó y se añadieron 200 μl de etanol al 70%. Se volvió a centrifugar a 15500 x g durante 5 min, se decantó y se dejó secar al aire el sedimento. Por último, el DNA se resuspendió con 10-15 μl de H2O
milliQ estéril.
2.2.5.2 Ligación de los productos de PCR
Una de las características de la Taq polimerasa que se utilizó en las reacciones de PCR (Taq Platinum, Invitrogen), es que introduce una base adenina (A) en los extremos 3’ del amplicón. El plásmido pGEM-T-easy (Promega) contiene una timina (T) en los extremos 5’ lo que permite la unión del fragmento amplificado mediante la acción de la enzima T4 ligasa (Promega). La ligación del gen GmCCS al vector pMALc2x modificado (modif.), ambos con extremos cohesivos conteniendo los sitios de restricción de las enzimas BamHI y XbaI, se realizó también con la enzima T4 ligasa. La mezcla de ligación debe contener, de forma aproximada, cantidades equimolares de plásmido y fragmento que se desea clonar para que la ligación sea óptima. Las ligaciones, tanto para el vector pGEM-T-easy como para el vector pMALc2x modif., se realizaron mediante una primera incubación durante 1 h a temperatura ambiente seguido de una incubación posterior durante toda la noche a 8 ºC.
2.2.5.3 Preparación de células competentes
La preparación de células competentes (permeabilización de la pared y membrana de las células) se ha realizado mediante el tratamiento con CaCl2 frío
siguiendo el siguiente protocolo. El día de antes se prepara un cultivo previo de 4 ml de LB (Pronadisa) con “un glicerol” de bacterias de Escherichia coli JM109 (Promega) o DH5α comerciales. A continuación, se prepara un cultivo de 25 ml en un erlenmeyer de 100 ml con un inóculo del cultivo previo. Este cultivo se crece a 37 ºC hasta que la D.O.600nm llegue a 0´4 unidades. Entonces, se pone 1 ml de estas células en tubos
durante 10 min a 4 ºC. Una vez centrifugados, se retira el sobrenadante con una pipeta y el sedimento se resuspende en 100 μl de 0´1 M CaCl2 frío. Las células competentes se
mantienen en hielo si van a ser transformadas inmediatamente o se guardan fraccionadas (100-200 μl) con un 20% de glicerol a -80 ºC para su conservación a largo plazo. Una vez descongeladas, se aconseja no volver a congelar las células competentes, ya que pierden eficiencia al descongelarlas por segunda vez.
2.2.5.4 Transformación de E. coli
Las células competentes de la cepa JM109 (Promega) y DH5α comerciales de E. coli se transformaron mediante choque térmico con las mezclas de ligación. Para ello, las bacterias competentes que se conservan a -80 ºC fueron descongeladas en hielo durante 15-20 min. Una vez descongeladas, se añadieron 100 μl de bacterias a 10 μl de ligación y se incubó en hielo durante otros 20 min. A continuación, el tubo conteniendo la mezcla de ligación se transfirió rápidamente a 42 ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 2 min. Seguidamente, se incubó en hielo durante 15 min. A continuación, se añadieron a la mezcla 850 μl de medio LB y se incubó durante 1 h a 37 ºC con agitación. Se centrifugó a 13000 x g durante 3 min para recoger las células y se eliminaron 700 μl de sobrenadante. Los 200 μl restantes de sobrenadante se utilizaron para resuspender las células. La mezcla se sembró en placas de LB con Ampicilina (50 μg/ml) a razón de 200 μl de mezcla por placa. La Ampicilina fue utilizada como marcador selectivo, ya que tanto el vector pGEM-T-easy como el vector pMALc2x modificado, confieren resistencia a este antibiótico. Tras incubar las placas sembradas a 37 ºC durante toda la noche, aparecieron abundantes colonias correspondientes la mayoría de las veces a clones positivos conteniendo la construcción deseada. Las colonias, así obtenidas, se numeraron y se inocularon algunas de ellas en tubos con 4 ml de LB y 100 μg μl-1 de Ampicilina para el posterior análisis de su DNA plasmídico de
forma individual. Los cultivos de uso continuo se mantuvieron a 4 ºC durante algunas semanas (no más de un mes). Para el mantenimiento indefinido, los cultivos se guardaron con 20% (v/v) glicerol a -80 ºC.
2.2.5.5 Aislamiento de DNA plasmídico
Tras incubar los cultivos en medio LB líquido con Ampicilina toda la noche a 37 ºC, se procedió a aislar su DNA plasmídico. Para ello, 3 ml del cultivo líquido fueron
centrifugados a 15500 x g durante 3 min y se retiró cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur. A continuación, se utilizó el kit de aislamiento de DNA plasmídico “High pure plasmid isolation kit” (Roche) según las instrucciones del fabricante. La elución se realizó con 10 μl de tampón de elución más 20 μl de H2O milliQ estéril.
Una alícuota del DNA plasmídico obtenido fue digerido con las enzimas de restricción adecuadas que cortaron el plásmido liberando el producto de PCR clonado. Los fragmentos originados en las digestiones se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa y se observaron bajo luz ultravioleta (apartado 2.2.4). Los plásmidos que habían incorporado el inserto del tamaño deseado se enviaron a secuenciar (Servicio de secuenciación del CNIO, Madrid) para comprobar la identidad del producto clonado y los cultivos positivos elegidos se conservaron en 20% (v/v) glicerol estéril a -80 ºC.