planteados en la presente Tesis Doctoral, se siguió el plan de trabajo que se describe a continuación, y que se muestra de forma esquemática en las Figuras 3.1 y 3.2. Los planes de trabajo se ciñen a las fases de ejecución mencionadas en los objetivos.
En la primera parte de esta Tesis Doctoral (Fase I), se ha estudiado el desarrollo de nuevas estrategias de extracción de compuestos bioactivos a partir de romero y su actividad en células de cáncer de colon (Figura 3.1).
A continuación, se detalla el plan de trabajo seguido para el desarrollo de esta primera fase:
1. Obtención de extractos supercríticos de romero en una única etapa a escala piloto, empleando parámetros de extracción previamente optimizados en el grupo de investigación. 2. Selección y ensayo de diferentes condiciones de extracción para la obtención de extractos supercríticos de romero a escala piloto en dos etapas secuenciales.
3. Caracterización química y funcional de los extractos y fracciones obtenidas en los apartados 1 y 2.
3.1 Identificación del perfil de compuestos fenólicos y cuantificación de ácido carnósico y carnosol mediante cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas (UHPLC-DAD-MS).
3.2 Identificación del perfil de compuestos volátiles mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
3.3 Cuantificación de fenoles totales (TPC) (método de Folin-Ciocalteu) y determinación de la actividad antioxidante utilizando los métodos de captación de radicales libres: 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) y 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS).
3.4 Determinación del efecto antiproliferativo de los extractos obtenidos en la línea celular de cáncer de colon HT-29 mediante el método colorimétrico MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium bromide).
4. Selección de las mejores condiciones de extracción del proceso en dos etapas secuenciales. 5. Obtención de un extracto de romero usando una mezcla de etanol y agua en condiciones
subcríticas (PLE) previamente optimizadas, para su uso como extracto de partida del posterior proceso de fraccionamiento supercrítico antisolvente (SAF) a escala de laboratorio.
6. Optimización del proceso SAF a escala de laboratorio empleando un diseño experimental de tres factores y tres niveles: (i) presión de CO2, (ii) porcentaje de agua en el extracto de PLE y (iii) relación másica de flujo de extracto de PLE/SC-CO2.
6.1 Estudio teórico de la selectividad del sistema de equilibrio ternario de fases SC- CO2–Etanol–H2O
7. Caracterización química y funcional tanto del extracto PLE de partida como de las fracciones resultantes del proceso SAF (refinado y extracto, para cada condición experimental), bajo los parámetros descritos a continuación:
7.1 Cuantificación de ácido rosmarínico, ácido carnósico y carnosol mediante UHPLC- DAD-MS.
7.2 Cuantificación de fenoles totales y determinación de la actividad antioxidante utilizando los métodos de radicales libres DPPH y ABTS.
7.3 Determinación del efecto antiproliferativo en la línea celular de cáncer de colon HT-29 mediante el método colorimétrico MTT
8. Selección de las mejores condiciones de extracción obtenidas del diseño experimental del proceso SAF a escala laboratorio, para ser ensayadas a escala piloto.
9. Adecuación y puesta en marcha del equipo de extracción supercrítica para llevar a cabo el proceso SAF a escala piloto.
10. Obtención de extractos empleando el proceso SAF a escala piloto.
11. Caracterización funcional de los extractos obtenidos, empleando los parámetros descritos en el apartado 7.1 y 7.2.
12. Caracterización química de los mejores extractos obtenidos de los tres procesos de extracción estudiados a escala piloto: i) SFE en una única etapa, ii) SFE en dos etapas secuenciales y iii) SAF (así como del extracto PLE de partida) por medio de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas con analizador cuadrupolo-tiempo de vuelo (LC-QTOF-MS).
13. Determinación del efecto antiproliferativo de los extractos mencionados en el punto anterior en las líneas de cáncer de colon HT-29 y HCT116 mediante el método colorimétrico MTT.
14. Análisis global de la relación del perfil y contenido de compuestos fenólicos de cada tipo de extracción estudiada en respuesta a la actividad antiproliferativa en cada línea celular ensayada.
En la segunda parte de esta Tesis Doctoral (Fase II), se ha investigado el desarrollo de estrategias de extracción para la obtención de extractos enriquecidos en compuestos bioactivos a partir de macro y microalgas. En la Figura 4.2 se presenta un esquema general de las etapas llevadas a cabo.
A continuación, se detalla el plan de trabajo seguido para el desarrollo de esta fase y se divide de acuerdo al tipo de alga empleada:
Sargassum muticum (Francia)
15. Obtención de extractos hidrolizados a partir de Sargassum muticum empleando dos tipos de enzimas (una carbohidrasa y una peptidasa) y estudio de diferentes tiempos de hidrólisis.
16. Caracterización funcional de los hidrolizados obtenidos, empleando los métodos de cuantificación de fenoles totales y determinación de la actividad antioxidante utilizando el método del radical libre ABTS.
17. Estudio del proceso integrado de extracción asistida por enzimas (EAE) seguido de extracción con líquidos presurizados (PLE), empleando como material de partida el residuo de alga posterior a la hidrólisis.
18. Caracterización química y funcional de los extractos obtenidos por medio de HPLC- DAD-MS y tal y como se ha descrito en el ítem 16, respectivamente.
19. Optimización de las condiciones de PLE empleando un diseño experimental de dos factores a tres niveles: i) temperatura de extracción y ii) contenido de etanol en la mezcla disolvente.
20. Caracterización química y funcional de los extractos obtenidos para cada condición de diseño, bajo los parámetros descritos a continuación:
20.1 Cuantificación de fenoles totales, determinación de la actividad antioxidante utilizando el método del radical libre ABTS y cuantificación de los florotaninos totales, mediante el método colorimétrico DMBA (2,4-dimetoxy benzaldehide). Sargassum muticum (13 localizaciones, costa Atlántica Europea)
21. De acuerdo a las condiciones optimizadas de extracción de PLE (ítem 19), obtención de extractos a partir de 13 muestras de Sargassum muticum, recogidas en diferentes localizaciones a lo largo de las costas del Atlántico Norte.
22. De cada extracto, obtención de una fracción enriquecida en florotaninos empleando protocolos de purificación líquido-líquido.
23. Caracterización química y funcional de las fracciones purificadas, por medio de cromatografía de líquidos bidimensional completa acoplada a espectrometría de masas (LC × LC-MS/MS) y tal y como se ha descrito en el ítem 20.1, respectivamente.
24. Selección de los extractos con mayor contenido en florotaninos y estudio de su efecto antiproliferativo en las células de cáncer de colon HT-29, mediante el método colorimétrico MTT.
Cystoseira abies-marina (Banco Español de Algas, Las Palmas de Gran Canaria, España):
25. Obtención de extractos a partir de Cystosiera abies-marina empleando PLE y extracción sólido-líquido, en condiciones previamente optimizadas.
26. Obtención de una fracción enriquecida en florotaninos, empleando el protocolo de purificación previamente descrito en ítem 22.
27. Identificación tentativa del tipo y grado de polimerización de los florotaninos presentes en los extractos purificados de C. abies-marina, por medio de LC × LC-MS/MS
28. Estimación teórica de los parámetros de solubilidad de Hansen para los florotaninos más abundantes, en cuatro bio-disolventes presurizados
29. Selección de las mejores condiciones teóricas de extracción, que proporcionen la mayor selectividad para el aislamiento de florotaninos.
30. Ensayo experimental de las condiciones seleccionadas y comparación con el análisis teórico.
Phaeodactylum tricornutum (Fitoplacton marino S.A., Cádiz, España)
31. Estimación teórica de los parámetros de solubilidad de Hansen de fucoxantina en cinco bio-disolventes seleccionados en condiciones sub-y supercríticas.
32. Determinación experimental del radio de interacción de la esfera de Hansen (R0) para la fucoxantina estándar.
33. Evaluación experimental de los diferentes bio-disolventes empleando PLE y SFE.
34. Determinación de la selectividad de los bio-disolventes en la extracción de fucoxantina, sometiendo a los extractos obtenidos a las siguientes técnicas de análisis:
34.1 Contenido de carotenoides y clorofilas totales, por medio de un método espectrofotométrico.
34.2 Cuantificación de E-fucoxantina por medio de HPLC-DAD-APCI-MS/MS.
35. Comparación del análisis teórico frente a los datos experimentales y selección del disolvente más selectivo.
36. Optimización del proceso de extracción de SFE y PLE empleando los disolventes más selectivos.
Figura 3.1. Esquema general de la primera fase del plan de trabajo llevado a cabo en la presente Tesis Doctoral.
Figura 3.2. Esquema general de la segunda fase del plan de trabajo llevado a cabo en la presente Tesis Doctoral. GP: Grado de polimerización.