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El trabajo de identificación de ácidos fenólicos por cromatografía de capa fina se realizó en el Laboratorio de Fitoquímica, Programa de Botánica, Instituto de Recursos Naturales (IRENAT) del Colegio de Posgraduados, ubicado en Montecillo, Texcoco, Edo. de México, y se llevó a cabo en el periodo comprendido del 26 de junio al 2 de agosto de 2002.

Se adquirieron los estándares de los siguientes ácidos fenólicos: ácido vainíllico (V 2,250 -- 5 g), ácido siríngico (S 6,081--1 g), ácido caféico (C 0625--2 g), ácido ferúlico (F 3,500--5 g) y ácido p-cumárico (C 9,008--1 g), todos de la marca SIGMA

(Número de catálogo-peso). La selección de estos estándares se hizo de acuerdo con lo reportado principalmente por Guenzi y McCalla (1966).

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2.2.1.1 Preparación de los vidrios para las placas

Se cortaron vidrios de 20 cm X 20 cm X 0.3 cm exactamente a 90o en una vidriería. En el laboratorio, los vidrios se lavaron con agua y jabón comunes por los dos lados. Se dejaron escurrir sobre una mesa y se secaron con papel higiénico.

2.2.1.2 Colocación de los vidrios en el porta vidrios

Los vidrios limpios y secos se colocaron sobre una base plana de plástico de color negro (porta vidrios). Se tuvo cuidado de que los vidrios quedaran lo más homogéneos posible. Para incrementar la fijación de los vidrios sobre la base plana, se puso primeramente agua en la base con una pizeta y después se colocó la parte inferior del mismo sobre las gotas de agua que se adicionaron a la base plana. Se colocaron cinco vidrios sobre la base.

2.2.1.3 Preparación de la silica gel y elaboración de las placas cromatográficas

Se pesaron exactamente 45 g de silica gel (C: C. F. 60 G F254 (5-40 µm) 7730 TA 963230 Sigma-Merk) y se pusieron en un matraz erlenmeyer de 250 mL. En la campana de extracción, se agregaron 90 mL de agua desionizada y se mezcló con la ayuda de una varilla de vidrio. Los vidrios colocados sobre la base se limpiaron con metanol, rociando un poco de este sobre la superficie superior de los vidrios y limpiándola con un papel higiénico, y se dejó evaporar hasta sequedad.

Una vez bien mezclada, la sílica gel con el agua, se vació sobre el carro y este se corrió sobre los vidrios para impregnarlos con una capa delgada de sílica gel y obtener las placas cromatográficas. Estas se dejaron secar en el porta vidrios entre 30 y 60 minutos. Posteriormente, sobre las placas de sílica gel, se marcaron cuatro líneas en los extremos, midiendo dos cm en cada uno de los lados y señalando levemente con la punta de un lápiz una línea en cada uno de los lados de la placa. Se guardaron en un porta placas hasta su posterior uso (comunicación

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personal Sr. Jorge Rodríguez, auxiliar del Laboratorio de Fitoquímica). 2.2.1.4 Extracción de fenólicos de la paja de trigo

Se pesaron 5 g de paja de trigo ( 50 mL) con una granulometría de 50 % de partículas entre < 2.00 mm y  1.00 mm y 50 % de partículas > _{1.00 mm y ≤ 0.5}

mm, y se colocaron en cada uno de seis vasos de precipitados de 500 mL y se les adicionaron 100 mL de los siguientes extractantes: agua común, agua a 60 oC, agua con pH 5.5, solución de NaOH al 2 %, solución de KOH al 2 % y solución de urea al 2 % (relación 1: 2 paja: extractante v/v) y se dejaron reposar por 1 h, al término de la misma se siguió la metodología señalada por Guenzi y McCalla (1966), con algunas modificaciones, que a continuación se detallan.

Los extractos se filtraron con papel filtro y embudos de vidrio; la paja remanente se exprimió y se desechó. Los filtrados se recibieron en vasos de precipitados de 250 mL. A los extractos (exceptuando el NaOH al 2 % y el KOH al 2 %) se les adicionó NaOH 2 N hasta un pH de 12 y se dejaron reposar por 30 minutos, posteriormente se les agregó HCl 2 N hasta un pH de 2.0. Los extractos acidificados se traspasaron a un embudo de separación y se les adicionaron primeramente 20 mL de acetato de etilo, se mezclaron y se dejaron reposar hasta que se observó la separación entre la fase orgánica y la fase acuosa. La fase orgánica se separó (fase superior menos densa) de la acuosa y se recibieron en vasos de precipitados de 100 mL.

La fase acuosa se volvió a transferir al embudo de separación y se agregaron 10 mL de acetato de etilo. Los líquidos se mezclaron con agitación y se dejaron reposar nuevamente hasta la separación de las fases en el embudo. La fase orgánica (fase superior) se recogió en el mismo vaso de precipitados de 100 mL en el cual se recogió la fase orgánica de la primera separación. A la fase orgánica se le agregó NaHCO3 al 5 % hasta alcanzar un pH de 8.5, después se agregó HCl 2 N hasta alcanzar un pH de 2.0.

El contenido del vaso de precipitados se transfirió a un embudo de separación limpio y se agregaron nuevamente 20 mL de acetato de etilo, se mezclaron las

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fases y se dejó reposar hasta la separación de las mismas. Se rescató la fase orgánica y la fase acuosa se retornó al embudo de separación y se le agregaron 10 mL de acetato de etilo, dejando reposar hasta la separación de las fases. Se rescató la fase orgánica en el vaso de precipitados en donde se recibió la fase orgánica anterior.

A la fase orgánica total se le agregó una pizca de Na2(SO4) anhidro para extraer el agua remanente para tener únicamente la fase orgánica. La fase orgánica con acetato de etilo se transfirió a un rotavapor y se evaporó hasta sequedad. Los sólidos remanentes en el matraz bola del rotavapor se disolvieron en 2 mL de metanol y se transfirieron a vasos de precipitados de 5 mL con la ayuda de pipetas Pasteur y posteriormente se transfirieron a frascos pequeños color ámbar con tapa, previamente identificados. Por otro lado, los ácidos fenólicos utilizados como estándares se disolvieron en metanol (3 mg del estándar en dos mL de metanol- 1,500 mg L-1_{) también y se transfirieron a frascos pequeños de color ámbar. Todos} los frascos ámbar se guardaron en una gaveta en la obscuridad.

2.2.1.5 Identificación de ácidos fenólicos

Para la identificación de los ácidos fenólicos extraídos de la paja de trigo con cada uno de los extractantes señalados, se sacaron las placas del porta placas y se colocaron sobre una mesa.

Se sacaron de la gaveta los extractos metanólicos concentrados de cada uno de los extractos obtenidos y los estándares. Sobre la línea inferior de una placa, los estándares se aplicaron de izquierda a derecha con la ayuda de un tubo capilar en bandas de 1 cm de ancho (un tubo capilar para cada uno de los estándares y para cada extracto metanólico), dejando un cm libre entre cada cm de banda de los estándares con la finalidad de diferenciarlos unos de otros. El orden de aplicación de ácidos fenólicos utilizados como estándares de izquierda a derecha en cada placa fue: ácido vainíllico, ácido siríngico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido

caféico.

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ultravioleta en una cámara obscura (Cole Palmer 9818 Series Darkrooms, Cole Palmer Instruments, Chicago) con la finalidad de exponerlas a la misma e inducir la formación de isómeros cis y trans. Posteriormente se aplicó el extracto

metanólico de cada muestra, teniendo en total 6 placas. También se dejó un cm entre el final de la banda del último estándar (ácido caféico) y el inicio de la banda correspondiente a cada extracto metanólico. El ancho de la banda de aplicación de cada extracto metanólico fue de seis cm.

En una cámara para placas cromatográficas se adicionaron 120 mL de la mezcla cloroformo-ácido acético glacial en relación 9: 1 (Harborne, 1984), se niveló y se tapó, dejando reposar por 15 minutos. Después de la aplicación de los estándares y los extractos metanólicos de las muestras en las placas, estas se introdujeron en la cámara para correr las placas (dos placas por corrida en la cámara). Cuando el solvente llegó a la raya marcada en la parte superior de las placas (16.0 cm), se sacaron de la cámara, se introdujeron en una campana de extracción y se dejaron secar. Una vez secas las placas cromatográficas se observaron nuevamente con luz uv de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) en la cámara para luz ultravioleta y con un lápiz de punta delgada se señalaron levemente los contornos de las bandas de los estándares y de los ácidos fenólicos separados químicamente, pertenecientes a las muestras. Las placas se guardaron en el portaplacas. Las placas se fueron sacando y se colocaron en la campana de extracción, y se asperjaron primeramente con 20 mL del reactivo de Gibbs (solución al 0.5 % de 2, 6-dicloroquinona cloramida en metanol) y posteriormente con 10 mL de amoniaco anhidro por placa con un aspersor, para su revelado. Las placas se dejaron secar en la campana de extracción, se sacaron y se colocaron sobre una mesa. Sobre las bandas reveladas, se midieron en el centro las distancias recorridas por cada uno de los estándares y los ácidos fenólicos presentes en cada muestra. Con el valor de la distancia media recorrida por cada uno de los compuestos dividido entre la distancia total recorrida por el solvente se calcularon los Rfs. La identificación de los fenólicos en las muestras por cromatografía de capa fina se hizo por comparación entre los estándares y las muestras con base en la reacción a la luz uv antes del revelado, los Rfs y el color después del revelado.

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2.2.2 Identificación y cuantificación de ácidos fenólicos por cromatografía