Mutant Sampling

En un primer intento por determinar la toxicidad intrínseca de los materiales A, B y C, esto es, el efecto general que el material pueda ejercer sobre cualquier tipo celular, se evaluó la viabilidad de fibroblastos de ratón (L929), una línea modelo para ensayos de biocompatibilidad recomendada por estándares internacionales[4]. Para ello se utilizó el ensayo de PrestoBlue luego de 24, 48 y 72 horas de incubación en presencia de concentraciones crecientes de dichos materiales. Las concentraciones evaluadas fueron 10, 50, 100, 500 y 1000 µg/mL. Los resultados se resumen en la Figura 7.4.

El análisis de los resultados muestra que la viabilidad de los fibroblastos, en general, oscila entre 80 y 140 % respecto del control negativo. No existen prácticamente diferencias significativas en la viabilidad celular en presencia de los materiales A y B para todas las condiciones de tratamiento, excepto en las máximas concentraciones de B luego de 24 y 48 horas de incubación, pero este resultado se normaliza a las 72 horas, volviéndose no significativo. Un caso similar se da a las 24 horas de tratamiento con 10 µg/mL del material A; sin embargo, el hecho de que la diferencia respecto del control negativo (C–) es considerablemente pequeña y que el número de células viables rápidamente se estabiliza a las 48 horas de co-incubación (volviéndose prácticamente idéntico al (C– )), hacen que esta concentración pueda considerarse como no tóxica. En general estos dos materiales, A y B, dan lugar a viabilidades que oscilan entre un 90 y 110 % respecto del control negativo, valores considerados normales para este modelo celular[11].

El efecto ejercido por el material C, este es, aquel compuesto por CeO2-TiO2, merece especial

consideración. Se observa un incremento aparente en la viabilidad celular en presencia del material que es proporcional a la concentración empleada. Luego de 24 y 48 horas de incubación los valores de viabilidad alcanzan máximos de 138 % y 134 %, respectivamente, que tienden a estabilizarse a las 72 horas, aunque manteniendo siempre la tendencia inicial. Es importante destacar en este punto que el marcador de viabilidad empleado, PrestoBlue, mide un evento bioquímico que ocurre cuando las células están vivas y que deja de ocurrir luego de que estas mueren. El metabolismo activo de las células viables que permite la reducción de resazurina a su forma fluorescente, resorufina, es cuantificable espectrofotométricamente y una disminución en la intensidad de la fluorescencia sirve entonces como marcador de muerte celular. Ahora bien, la afirmación opuesta, esto es, que el

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aumento en la intensidad de fluorescencia está siempre relacionado con un aumento en el número de células viables no es necesariamente verídico para el caso de los fibroblastos ya que éstos son capaces de mantener su metabolismo muy activo aún en estado de quiescencia. La alta actividad metabólica observada para este material podría deberse tanto a un aumento en la proliferación celular como a una activación de la síntesis y secreción de moléculas de la matriz extracelular[12].

Material A

Material B

Material C

2

4

h

or

as

48

h

or

as

72

h

or

as

Figura 7.4: Viabilidad de fibroblastos de ratón (L929) en presencia de los materiales A, B y C luego de 24, 48 y 72 horas de incubación. El efecto citotóxico fue medido utilizando el ensayo de PrestoBlue. El control positivo (C+) representa células tratadas con Cd-Te Quantum Dots en una concentración tóxica efectiva de 500 µg/mL. Todos los resultados están expresados como promedio ± desvío estándar de tres réplicas y están mormalizados respecto del grupo de células sin tratar (C-). * p < 0,05 ; ** p < 0,01 corresponde a valores significativamente mayores o menores que (C-).

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Para descartar que este efecto se deba a un aumento en el número de células viables basta con observar las intensidades de fluorescencia absolutas que presentan las células sin tratar, esto es, las correspondientes al control negativo. Aprovechando el hecho de que el cultivo celular de L929 es muy reproducible, es posible estimar el número de células viables presentes en el medio a lo largo del tiempo a partir del número inicial de células sembradas (5000 células/pocillo) si se tiene en cuenta que el tiempo de duplicación calculado para este modelo celular cultivado en las mismas condiciones es de 30 ± 2 horas[13]. Este dato permite hacer una aproximación de la cantidad de células que debería haber presentes en el cultivo al cabo de 72 horas y la intensidad de la fluorescencia correspondiente a ese número de células.

(a) (b) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Flu or esce ncia (u .a. ) Tiempo (horas) Control negativo (C-) esperado Control negativo (C-) observado

[C-] [10 ] [50 ] [10 0] [50 0] [10 00] 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Flu ores ce nc ia (u.a .) Concentración (g/mL) 24 horas 48 horas 72 horas Material C

Figura 7.5: (a) Relación entre la fluorescencia observada y la esperada para el cultivo de fibroblastos de ratón en ausencia de materiales (C-) al inicio del ensayo de citotoxicidad y luego de 24, 48 y 72 horas. (b) Valores absolutos de fluorescencia para el ensayo de citotoxicidad en presencia del material C al cabo de 24, 48 y 72 horas de incubación.

Como se aprecia en la figura 7.5 a), la intensidad de la fluorescencia crece linealmente en el tiempo a medida que el número de células aumenta. Sin embargo luego de 72 horas de incubación, la intensidad observada se desvía considerablemente del valor que uno esperaría encontrar para el número de células estimado en caso de que éstas se hallasen proliferando activamente; más aún, la fluorescencia medida no difiere significativamente de la obtenida el día anterior (t= 48 horas). Esto sugiere entonces, que los fibroblastos alcanzaron la confluencia en el pocillo y habrían entrado en estado quiescente. A partir de esta premisa, es posible cuestionar que el aumento en la intensidad de la fluorescencia observada luego del tratamiento con concentraciones crecientes del material C (figura 7.5 b)) se deba a un aumento en la proliferación de los fibroblastos.

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